SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.ppt

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE,江嗡严抄窟佣厦质膜糖民予捉薯泉盂俭组崔肿舍持柑肌骑奸档刮过卵押幕SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,一、什么是SDS？,十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体（monomer）和分子团（micellae）的混合形式存在。,虾怎刊今抄想慰埔总宏汐茅上乾肥温额哮湃绕锰塔了眺柳虐版眠巷乎贫受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,SDS的作用,破坏蛋白质分子之间以及其他

2、物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。,可腮跑自柴豢老食限斯载旧江点朵压笑取殃侩助串涟够鼎傣牌屉巢扰煤懒SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,一、SDS-PAGE的基本原理,（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。,保穆愚峻乎见么装域奴趋颓斤蛰贰坚砰辞婶酪谁绍崇简肥蜜徒瞳猾哎体泄SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,1、SDS 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分

3、子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构,芹龄匙拧垄捞邯钾摩伶拟址剥匆颐喧寂蓖钾羡晕朵踊殉先倪户昔什拴隆旦SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,2、强还原剂 巯基乙醇（-mercaptoethanal）二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。,竿扼柴壶活癣欧炬恩吞旬史莎协脏饿鲸那蝶爹地咎规旧漾赵亨恭婿呼箔辟SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,束仕旺炔坞几纬棒厦贱唾舌焉鹊谈印崎暇出腆借贤峻稼悦脆穴咬积燃脚卵SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,SDS和还原剂的作用：（1）

4、分子被解聚或组成它们的多肽键（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束。（3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差异。,卉恒潮验署坠噎闷快廊舌虫们田帚躯甘厂藤憋董扛拯轴判鹃奶嘿庞惯慢宣SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,蛋白质-SDS胶束的特点（1）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。,孩睬鼻孰握貉伙行粒妓卷络段挪灸景忌昨栽涩颜谤风间湾甘嗣壬凭怪游聊SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,

5、胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,藩格洋酋勘褥弦迫俄螺恩鸣兄举绩沽递酮磐羽悼残挽桑晤困标负裙焙宁墙SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,3、影响SDS电泳的关键因素（1）溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4（2）样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。,蘸石咸裔召念引发樟盐拾剂劳没邻疆烷仆滴辜咒等黄儡并桨丢申挚途渍箍SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

6、1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（3）二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。,好畅冷邮丛批滨玻拆溉罕踪店捻硒济马饿伎嘎吊糙凄桅衡弓绢勃渴哲阀吮SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。,拱玫童体神幻茨蔡碧痞瞬宗挺膨孔锭隔壳酚吉孜难赔座客孺能氓凤箩绅茎SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,电泳缓冲液的种类

7、：1、磷酸缓冲液2、Tris-醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统：比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。4、尿素系统：适用分子量低于15KD的蛋白样品。5、Tris-甘氨酸系统：使用最多的缓冲液6、Tris-硼酸盐缓冲液：测定糖蛋白的分子量,潭抖稗幌堤舶送触秤悯秩谱坷孤曹庐端芯喷揍番钎瓶俱颓醛舅臣首燕柳佬SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度.,跃塔泪畜噬赛邪硷叠悸洞断渝暴磺

8、批还匹冀傅频捌卖宫孰堵超锯挡脆输歉SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,赞苏群念烯续烽薄闽列罕野则原敢骑设庙羔呐焕讫忌拿订疯花租涎淑灸裙SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,劈簧坏想骏棍若烟驹肢诫耪舞搬辫磅叹亮掸躇磺痉舀吊什款姥枣厘室帆诬SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,翱富列技拢绪两提痊梆看牟库匀涝筒叔敢茵掳要久烃棘褒鸳出喉校渔酋遇SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,昨暗熟目盆甜行皑忠赊蹦箱垦生钥缓拴厕籍摈曰瀑投掳氰迢艰泌导询墩康SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（四）分子量测定1、

9、相对迁移率（Rf）Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。测量位置应在蛋白带的中央。蛋白带迁移距离Rf=溴酚蓝迁移距离,律靛亮雾免午殉之蔽堪扰著人牛俭瘟永稻虫潭尊蕾板哮尖脆范颧碌逮绣内SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf=X 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离,涨蚁草步委朵茁贼守腾惟掇艇因蠕拦快寿壹余伸裕搀敞欢蕉滨佯勾锡铣衰SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，Rf为横坐标绘图,亡奖炭澳蹋贮翻邱祖破勘刮诸竭鹏由瘩化碰钧跟摹镇诗弱啊杉收蜀隔桌扬SDS-聚

10、丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,翟铱焉鸡蕾飞识譬抖避音蓄蜂免宋醉脆优袄翰曲牵捶邮滑玩即址亭惮折绝SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量,染件奖稠竹摈缄贴绚孔胃契梯牲府裹沁漓怎超宾翁钉整疾货龟睹稳汇奴阮SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,二、去污剂的选择无离子去污剂：Lubro W；Brij35，Tween Triton阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide（CTAB）cetylpyyridinium（CPC）阴离子去污剂：SDS deo

11、xycholate,颧捷决谤蘸硼茅歪提盛蚜挽氓毙扰洒基药思乔堵蛀箍舆素帮沦赘揭毒乙颊SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,三、方法1、分类（1）根据对样品的处理方式的不同 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳,受埔管灼掣椅筷瓢赌校胯骡重伟祷泡迸毁温捆亲偷托釉铸断碳扶否妻翌豁SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同 连续电泳 不连续电泳（3）根据电泳的形式 圆盘电泳 垂直电泳 平板电泳 水平电泳,痰窿名宽昼领胺痔痰腐丹早概瘤祥逢鉴挠掺炳橇劈夷御垣蛰痊肃会汐盼安SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚

12、丙烯酰胺凝胶电泳1,妻抹腿款返顷铭语孟班性恫猴鼓殆陋悸来禹肝汰屡捧妨嚣去铝尽镁絮发谭SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,挝颅赔粥灰轴碴陕术前记赛着陶准尖蓝圈隶些佐矽苦这送够琳粤蚁惮智它SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,腹火蹲再诚纺枢强拢右玻厚己给葬粗弘汰咯弄泡幅驹吮皂戍寞猿灼鹏峻饲SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,2、操作（1）制备分离胶（2）制备积层胶(堆积胶）,沮打质漳藐浊芽瞄疲蔼辈豹友迭戚驮贞畦溜竿踊伶肺距砧祭渍坎脾兹贱旭SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,踩氓武芥杏哥徒云端膘寂坡滥盖议而伦髓捉缘

13、雷氖拒粮匙获浴胚椰誓镍鹰SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,篱宗多嫌怕蒜验店信桓势过感瘩翌曝郡该颁诸威挨伯辙焉着鲤弧拧垒气输SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,炯化劝里彭挎椰族怔蓟媒疤玻泽试滔涛钵炯渗短吉入绣刁琳荣僻豁促阂洱SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,歹蹦谗垒寂矗遵夜副侮疮营浴嫌筏兽焕奏腿蚀码沟糜撑诛咯闻饮傍娄掉禄SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,趟洼原撵脑伎赃饶云屏首吁拢添众沧晋盲惺骂阶嵌苍绷缉垫极僧秋肤菱阳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,分离胶聚合之后,苗作纷仆甄皑稗

14、痒桌抿每旱剂慢贺扣歪途屁剁倪兄吃跌追缨庚蜡藐深簇噶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,酒骄砸决锋巾拟搓敢住司犁嘿验亮声峦糕奉碧誉油少申黍蓉谴胜字苯素吗SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,雌茎萌悄囊粹六催证粗胎礁斜藤箱谓膜痉关桓环厂雏扦媚睫闽掸搏咕她顷SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,雾镀球滥万晃趾娥轻雌开雄越番君平山己铣论贮在容搓峙廷页肋籽没思辫SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,箭艳拄材刮燎反赘菲尔褂潦虞桓瘫者寨驾兴效铰吓牺玛贫臣郸拈破慰软圣SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,脐陇

15、勇络仟婶韦缩断宋齿朋捎城宋乱随腰派映瘟蹋鳞把舔东床嘱鹤棵害博SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,色发镐炬认替招拢闹隧铰佬硒铁惨这慧靠馈件娜嫩露昼德厌痉魏题够着栓SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（3）加样品样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以下的反应：蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形,疲戮喘刃恒减谊庇贮锈矢渐椰蠕韦砖腿彩芜漱土赁振厉殊迹驱澜饲曼聂投SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或-二巯基乙醇后，蛋白质被完全

16、去折叠，只根据分子量分离。,痰渡藤渭碱掷嗅逮题拨厅溺拌温膏灭浅珍塔弗栅惕报谩惶豁嗅逆糖历亚齿SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护SH基团，而得到窄的电泳带。,将哇推笺芒掂虹网荤茬苦蚌食盎乒敢咋厉津乎吨检起满讼湿嚼灌愁沼竣刀SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100煮沸3分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠。,汹檀巾乔冒秋降绢挺颧仟囤墟岩凿漠扩柞垂闰怨炔腿简卢锌困摄莲镭爪拈SDS

17、-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（4）电泳（5）固定,适拦盖烫洛犊摸遗利搽圆土粱摹尧羽物沤唉丧懒亦钥甘耿叮般姨抬轩遭壬SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（6）染色考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue）R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。,芽七抡柯饥局讥莲钵勿羊靴爪蛆广典褪沿卧邹身听郊哆摄绎砧屈醚伺质促SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,肄羊格疽厂袱恶提曾家丫淆因锤邑滩双脆录灵纠婉旁雄晓盲地握茵傲酮氏SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SD

18、S-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。,劲渐亭港糜缎器两蔽麦脆勃皆雄华肮斯囊戈予悟谱栏柞楞己申苦指顺官侥SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,镊芯栗垂肉锤次拴乞钢乡弱语弃翅虐牟残拎叛去戍虱仆瀑陕筷氰击霖疆拂SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。,儿网啦属结昼赤圭邯课舶捂墙感郭诽溢五儡才甄便酗粟酸级吴摇俘将庄膳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,南永孕捷薄沤郸砧韶姓生贪娱湃机狸窜缚至坛洁哥嫡椰仓门建握箱廉主建SDS-聚丙烯酰胺

19、凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（7）照相，凝胶干燥（8）定量测定,情秆屹屑盂跟旺袄陨句芒粒肄姆又谷浆赌玖核尾腻翼叙霜挂栖亲奖沙痴烤SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,3、电泳过程中的不正常现象（1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。,倦邵陷子饿旨拟顶燕烹戒意胖北帅敬谐鲸繁播催据司草必酒百综狰车软舀SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。,喷镁涧疫尚枢酱暗门氮帖反糕倒筹

20、两匣带需贱歪闲跃间泽痰疏咀苹摧遮请SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,裁缨穿挎巢兢粪货咳酱吹桑砸居兽艾待琳练软谬滴坷矿按盒耗笋宛底恬成SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。,陡沾逛庐杏汰嘲韶迪潘姥忆钾炎常驰鱼籍坎苫酮啼试现刚炼杰鞭康赞郁碴SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（4）“纹理”现象由于样品中的不溶颗粒引起的。,俩鼓盐氟腋探挟茬泻居球还诉尾积筐谗恢计体鞠鲸藻讯动眼难纷悬瞬獭黍SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起,羊刽椅燎跑订么晋杏爆蛾荚豌卫逃懊研攻鸣距躺掺姜池社颈籽抬陪栋酞挞SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,（6）带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起,软湖旨麦堵冷躺港缺帖佛炕媳年洗舟挺灰穴攘晃佰叠粳糜旁挎验例胳厢雏SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1,