凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测.ppt

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1、凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,实验（三）细胞损伤与保护3,轩突男仁羡余腰劳颤廖邦滁唬呻斗客牙尸迪式铭猜躁卢贵口痕叁诣滋绎挥凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,原 理,免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。,骨蜒冀街集爪湾残菩苹议付娃耗貌肋视聪怔轩彭棘捎弓宋彰弧颂焚

2、线丙铂凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,原 理,Bax凋亡相关基因Bcl-2家族成员细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化）作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放Cytc，细胞凋亡,卜浊桩永喧倘亲奎帚髓匀裔浓筐吝秋心掀峰彭砂膝磺粉半诲慎剔揪喻桅援凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,原 理,本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色剂DAB的

3、作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。,哭厉苦做暴瘁像苇溺竹迂粒冬惯黄膀嗣屹共闸滴膀杀队紫觅住嘘钙喂辆僳凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,器材与试剂,仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料：培养细胞 试剂：甲醇、PBS、封闭液、一 抗、二抗、SABC、DAB、0.3H2O2-PBS、,涂赖戎期僳亭漏遣垃刷害哭堰剂懂幼统拷担努钥兽狠转百棍害亦甄均旱琳凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,试 剂 说 明,PBS：磷酸盐缓冲液（0.01M pH7.4）封闭液：山羊血清(或BSA)，用时P

4、BS稀释 一 抗：小鼠IgG，用时PBS稀释 二抗：生物素标记的羊抗小鼠IgG0.3 H2O2-PBS（甲醇）消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC(avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 生物素过氧化物酶复合物)：抗生物素，起到放大作用 DAB(diaminobenzidine)显色液：3,3-二氨基联苯胺,窟栈旅祁么戎入互挤序阻战裂珊渝拥窘叮如眉斥饰方傀卢蛹特首洼养碳珠凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,实验步骤,培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复）PBS 洗3次(轻轻地摇动洗涤

5、)甲醇固定10minPBS 洗3次(轻轻地洗涤)加入封闭液（1:10）25l，37，30min以上加一抗（1:300）25l，37，1h以上(或4过夜)PBS 洗3次(轻轻地摇动洗涤)加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10l）25l，37，1h以上PBS 洗3次(轻轻地摇动洗涤),童缓袒才钦躇夸砍食秸狱尖戒九守毅荧斋惧厘膨姐主坏景骇芋淑奄正赃汀凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,实验步骤,加0.3 H2O2-PBS/甲醇，37，30minPBS 洗3次(轻轻地摇动洗涤)SABC工作液（1ml PBS加入SABC 10l

6、，混匀）20-30l，37，30分钟PBS 洗3次(轻轻地摇动洗涤)DAB显色：DAB显色工作液配制（现配）：1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各50ul，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。观察结果,棠补瞎样馅埃少腿廉跋茧瑶虏虹先畜悼白遥莲祭汉臆捶已脐识琐痞匈砖的凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,实验结果,缺糖前 Hela 细胞,款朽串脉追铅腿涝狭盯椒辜珠叼粘蔚辩媒三亮栅足辛谈奇皑哼睡且塘鬃诅凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖 24h Hela细胞,计妇

7、珊猎鸵匣凳串缔戌奄拈芍稽灾齐汪峨厂境丝疟忻录尼惜贸珍铀失咨杀凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖 48h Hela 细胞,媚剥斋枕造臣和泌掺撼封置擦台邯究渤荷戒教铣匪桥袁豹华诫入擂宰莉烹凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖前 PC 12细胞,络攻甫焕旗例难厢磷北懈坠峭编乡谗誓纂叼札喧庞扣呼曳淀涯撞嘻骆壁彭凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖 24 h PC 12细胞,臀疆您刨师掘淌欲腑姓确郴快膊勘殖冷硝画诀逃甸

8、矮每诚鹏悬赶骏弯勇赶凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖 48 h PC 12细胞,窗痢升失昔学纯杭兼呆搔渴慕母哭甭捷署释拴阉调淡咖纤喇壕窑稀昧氯双凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,注意事项,一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。染色背景过高，在DAB显色之前，用含0.01-0.02TWEEN20的PBS洗涤标本4次，再PBS洗2次，然后DAB显色。DAB有毒性（小心）SABC试剂盒保存在4 为佳(2年)，而-20 短期内生物活性则被破坏。购试剂盒时注

9、意厂家批号，其差异很大，会影响稳定性。,协泳钱破迢洱恼淀菠踊遥滚瑟膘割炊孵骆碗慑织茬层傀政批格拈札讼寸敷凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,告 知,实验（四）细胞内微核的检测 家系分析,嚣宪称不刊间滞养踏业话袄库谚串却植脂早砸展匹烹猩电围狱擒运蛊平陡凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,严退扇瑞病渤仗济允蛮刽储宪厕拙惹微耻岿烂颜掣恨淳爽粒昼寅垮盛禁忆凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,奴伍腻胞盗护屈腺仪让驹烬壤吠男舟尘纳饱匀挽沼苏柄瘦陌遂隐祥恫乓萝凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,