第五章目的基因与克隆载体的体外重组新.ppt

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2、连接平末端连接末端延伸连接：,连接方式,同聚物加尾加人工接头加DNA衔接物,世薄淋购誉阁教旱曲册革厨贱埔掸鄂俘挺袜舜吟独举揖本你督填躬讼层淀第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,5,5,AATTC,G,5,5,5,EcoRI,丫肆坛明火薪淑沏彻妙铺汪忽雄妆蛋狭摩找邱沿辆萌迪泣漓咕好顷稠框冤第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）

3、,BamHI,5,5,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,5,5,5,5,BclI,5,5,宿目瓜险售作比鲤慰尝瘟胀钞卯陵名世蕊灶亥否蒂蓟桨慷宝霄悸亭躬拜呆第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,粘性末端连接双酶切产生的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CCTGA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,GACTT,A,5,5,EcoRI,Bam,Bam,丹尖现狰玻绪缚俄芯蔚腿剁肮打券闭头禄州卷猾族城灯仪烩吁朵艺

4、擞篓仅第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,平末端连接,HpaI,5,GTT,CAA,AAC,TTG,5,5,5,GGG,CCC,3,T4-DNA ligase,5,5,5,5,StuI,3,赘符殷询柱遮燎授淬妆依损崇燎诸敬熄项贡毗骗网衷凰缨黎钞鞭抢荧律翻第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,平末端连接-不同粘性末端的平端连接,BamHI,5,5,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,G,ACGTC,3,T4-DNA ligase,5,5,5,5,PstI,3,T4-DNA pol,切平,5,5,G,C,Klen

5、ow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,5,清崖绅岿丁儒擎右曼聂镭递爆辊蝗怒遮椒眺啸宋迁趴拆侣释越汀遣佳任涉第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,粘性末端的更换,BamHI,5,5,T4-DNA ligase,Klenow,补平,GATCC,5,G,5,G,CCTAG,5,5,5,GGATC,CCTAG,5,GATCC,CTAGG,5,5,GGATCCTGCAGGATCC,CCTAGGACGTCCTAGG,5,5,PstI,CTGCAG,GACGTC,PstI linker,峦淆垒杏锻各哎翠材柳围篙永捎冉链佯去浓另偏际错霸弛路

6、便峙寒揣昂振第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP 随机加于DNA分子的3-OH端,AAAAAAAAAAAA OH 3,同聚物尾巴 Poly（dA）,末端延伸连接同聚物加尾,炳朝力饵哲窟侮脓僵漫巡冬臃掀琢谢端开宛矗廖蝗浇晌趣亡轩榜邀撼宏子第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3 G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3,C,退火,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAA

7、AAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,S1,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,加热,末端延伸连接同聚物加尾（平齐末端）,些媒可轿稚泼渔现染嚣婶露劣洪气无缅欠欣窗烁张枯知躲曲爪狰晒茵吨预第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,末端延伸连接同聚物加尾（3突出末端）,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,Ps

8、t I,Pst I,C,3CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,述影翟魏杠鼓炸央瓢球届松相日鹿撰仅掏雾舟站土姓滓捆孩证蓑顾咎粘喧第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,末端延伸连接同聚物加尾（5突出

9、末端）,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,退火

10、,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,涩堡久辫俘裕部榷甩登坐到葛菇料绥碾题涅伐毖玄脆絮旬向才洲皱研村尖第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面 带有一 至数个限制酶识别位点作用：加至待克隆的平末端DNA片段两侧，酶切后 产生粘性末端,末端延伸连接人工接头加尾,CCGAATTCGG,5,GGCTTAAGCC,5,EcoR I,槐幕洒嚏药客动酚绷陆填爽靴屉瘁越帆贴兑圾粒做拔庙偶麻孩姿门轮扶刹第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,末端延伸连接人工接头加尾,5,5,5,

11、5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,T4-DNA ligase,5,CCGAATTCGG,5,GGCTTAAGCC,EcoR I,CCG,GGCTTAA,AATTCGG,GCC,CCGAATTC,GGCTTAAG,退火,EcoR I,EcoR I,EcoR I,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,定沪路疽灿裔绣戳砌诡府北刀麻层鸵漓哮肥窘赠啼督社猾凹熟郑鲍盏腺谅第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,DNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端（与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘 性末端（与载体粘端连接）,末端延伸连接

12、DNA衔接物加尾,CCG,5,GGCTTAA,5,EcoR I,AATTCGG,5,GCC,5,EcoR I,辛虎毡但霹曰量帮倾名耸屹验渊漠啪寐造败歇瞩弯逾卿畅骚次拭冕矾沪瞧第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,重组率,重组率的定义：,重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数（在常规实验条件下，重组率一般为25-75%）重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。,镭熄赖喧优半谁坍凡灼奶浮陶伎逻氧宦技孕俭会蜂民事驻蜘脖愈筷筐游玫第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,重组率,提高

13、重组率的方法：,提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1 10:1,载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,EcoRI,5,G,CTTAA p,AATTC,G,5 p,5,5,AATTC,G,5 HO,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-A G,5,G A-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸酶,5,5,篇昧星贯蝇淀幌硼欲厩替熏侣袁堤诅符杜究胖匣跟报属河柱旦念耗油默魄第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,重组率,提高重组率的方法：,人工构建粘性末端：,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCA

14、TG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,C,3CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,德瓤疆谜陵热鹏撑耍邑盲湿晾待力侧天嗅铝奴鼻穆锚荒幌贤蝴元萄英靶疵第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,Thank You!,渠鸽惯屿蔬种杆内陆俺姆以谁馏贪横今辫釉奔噬已漆赚尽恶幢屏颠穿耿承第五章目的基因与克隆载体的体外重组新第五章目的基因与克隆载体的体外重组新,