实验动物胚胎工程技术.ppt

《实验动物胚胎工程技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验动物胚胎工程技术.ppt（72页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、,1,第十二章 实验动物胚胎工程技术,2,第一节 概述,工程:通过构想、设计，按照人们的意愿制作、改造某一事物，以达到预想的目的。生物工程：按照工程学原理，对生物体或生物大分子进行改造或利用，用于生产、研究、检定和创造新物种的综合性科学技术。遗传（基因）工程 蛋白质工程 酶工程 细胞工程 微生物工程 胚胎工程 组织工程,分子水平,细胞水平,组织水平,3,胚胎工程（Embryonic engineering）又称胚胎技术,是指用工程学的原理对动物的胚胎进行某种技术操作或改造，使之获得人们所需要动物的一系列生物技术的总称,包括以下四大技术体系：一、胚胎操作基本技术 1.超数排卵和卵母细胞、精子、受

2、精卵的采集 2.体外受精 3.胚胎性别控制 4.胚胎分割 5.胚胎培养 6.胚胎移植 7.胚胎冷冻保存二、体细胞克隆技术 三、干细胞技术四、外源基因导入技术,4,1在畜牧业方面：通过建立超数排卵、受精卵/卵母细胞的采集、体外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体细胞克隆以及胚胎移植技术，加快良种家畜的繁殖和家畜品种的改良。,胚胎工程的应用,5,已在乳腺表达的生物活性蛋白并进入临床2期或3期试验：抗凝血酶一抗胰蛋白酶蛋白C乳铁蛋白乳糖酶,2在生物制药方面：通过转基因技术将具有药用价值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色体上，使其在乳汁、血液、尿液等体液中表达。通过收集、纯化这些体液中的生物活性蛋白，用

3、于预防和治疗某些人类的疾病。,6,3在医学方面：通过建立卵母细胞的采集、体外受精、显微受精以及胚胎移植技术，用于不孕症的治疗；通过对胚胎培养和检测，剔除具有遗传性疾病的胚胎，达到优生优育的目的。4在生命科学研究方面：阐明哺乳动物早期胚胎发生、发育机制等基础理论 5在拯救濒危野生动物方面：通过野生动物生殖细胞和组织的冷冻保存、体细胞克隆和胚胎移植技术，扩大野生动物的种群。,7,第二节 胚胎操作基本技术,8,胚胎操作的整个过程局限在胚胎的早期发育,9,解剖取附睾尾部,精子的获取和培养,1.精子的采集 啮齿类小动物精子的采集大都从体成熟雄性动物的附睾获取。将动物处死后，分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端

4、剪一小口，用手指轻柔挤出浓稠的液滴，置培养液中培养。大动物的精液采集可采用假阴道或电刺激方法促进雄性射精，收集精液。,一、精子、卵母细胞、受精卵的采集和超数排卵,10,2.卵母细胞和受精卵的采集 在哺乳动物中获得卵母细胞的途径有两条：从体内成熟并排到输卵管中去，需通过处死动物或外科手术获取；如果在交配后，则可获取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰的或刚死亡的雌性动物的卵巢，从卵巢中分离卵母细胞经培养而得。,小鼠解剖取输卵管,从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵的方法,11,3.超数排卵（Superovolation）技术：通过注射激素刺激卵巢大量排卵。经超数排卵处理，动物卵巢大量的卵泡同时成熟并排出，

5、排卵数可增加几倍至十几倍，一次可获得大量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。所用激素有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三种常用。,12,13,体外受精（In vitro fertilization）是指成熟精子与卵母细胞在体外环境下完成受精的过程。这一过程包括卵母细胞的收集或未成熟卵母细胞的培养成熟、精子的获取、获能处理、受精及受精后胚胎培养等。体外受精联合胚胎移植技术（IVF）又称试管婴儿。,二、体外受精,14,性别控制的研究，是畜牧业生物技术中一项重要的高新技术。这项技术的应用，可以使畜牧上大动物的繁殖按照人们的意愿

6、只生产同一性别动物。在医学上，性别控制的研究也具有积极的意义。有的遗传性疾病属于性连锁遗传，例如进行性肌营养不良，为X连锁隐性遗传，男性发病，女性携带异常基因但不发病。携带此致病基因的女性怀孕后如做胚胎性别鉴定，则可避免男性患儿的出生。,三、胚胎性别控制,15,性别控制技术通过对X精子与Y精子分离以控制性别在胚胎移植前对胚胎的性别进行鉴定以控制性别通过控制饲料特性、受精环境如改变精液或阴道的PH值等来控制性别。,16,（一）分离X精子与Y精子以控制性别 分离X精子与Y精子的依据：X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。将X和Y精子分离再通过人工授精可以有效地达

7、到性别控制的目的。目前将X和Y精子分离的方法有沉降法、电泳法、免疫法和流式细胞仪法等。流式细胞仪法是当前分离X、Y精子较准确的方法，具有重复性、科学性和有效性的特点。,17,应用流式细胞仪分离X和Y精子的原理：X精子的DNA含量比Y精子的高。对于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8，由于染料着色量与精子DNA含量成正比，因此X精子吸收的染料多，发出的荧光就比Y精子强。,正常人染色体,18,具体的做法是：先用DNA特异性染料对精子进行活体染色，然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束。探测器根据精子的发光强度把电信号传递给计算机，计算机指令液滴充电使发光强度高的液滴带正电，弱的带负电。即X精子带上

8、正电荷，Y精子带上负电荷。当经过高压电场时会向不同方向偏转，达到分离的目的。,19,（二）对胚胎进行鉴定以控制性别 在胚胎移植前对胚胎的部分组织用染色体检查、间接免疫荧光法和PCR法进行性别鉴定。其中PCR法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特点，近年来得到迅速的发展。Y染色体短臂上有决定雄性的DNA片段-SRY基因(sex-determining region of Y-chromosome,全称:Y染色体性别决定区)，为胚胎性别鉴定提供了可靠的途径。,20,21,胚胎培养是指将获得的早期胚胎在体外人工环境中进行培养，以观察其发育或人工干预某一发育过程的可能性。,四、胚胎培养,22,胚胎培

9、养一般应用于以下几个方面：1未成熟卵母细胞通过体外培养，成熟后进行体外受精。2受精卵通过体外培养发育成各阶段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷冻保存。3冷冻保存胚胎解冻后，通过体外培养，筛选成活胚胎用于胚胎移植。4通过研究胚胎发育的环境和条件，不断完善胚胎培养条件，揭示胚胎细胞的生长发育和分化的奥秘。目前胚胎培养技术已经可以将未成熟卵在体外成熟，并通过体外受精发育成各阶段的早期胚胎。即使如此，在体外胚胎培养也只能发育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到动物的子宫内。,23,-胚胎工程的最后一道工序 将受精卵或发育到一定时期的早期胚胎,移植到受体动物生殖管道的一定部位,能在子宫内着床、生长、发育、分娩、

10、出生仔代动物的技术称为胚胎移植。几乎所有的胚胎工程技术在体外完成对胚胎的操作后，都需经过胚胎移植这一步骤，得到我们所要的动物。,五、胚胎移植,24,体外培养的胚胎必须移植到同步发情的雌性动物生殖管道内。解决同步发情的方法有两种：1.利用自然同期发情的母畜，此法在实践上较难办到；2.通过注射某些药物(如孕激素、雌激素等)诱发同期发情。不同发育阶段的胚胎移植的部位不同。受精卵和2细胞胚胎应移植到输卵管内，而桑椹胚和囊胚期胚胎应移植到子宫内，以跟正常妊娠生殖生理变化同步。,25,同一种属内的不同品种品系可互相进行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封闭群ICR的生殖管道内；日本大

11、耳白兔的胚胎可移植到雌性新西兰兔的生殖管道内。这一特点在畜牧业特别有用，如为了加快良种奶牛的繁殖，可将良种奶牛的胚胎移植到普通黄牛的生殖管道内，借腹怀胎。,26,胚胎冷冻保存（embryo cryopreservation）技术是指在低温（-196液氮内）条件下利用低温保护剂保存生殖细胞及胚胎的一门技术。,六、胚胎冷冻保存,27,（一）胚胎冷冻保存的机制 低温降低了胚胎内的生化反应速度。并且温度越低，保存时间就越长。低温损伤：如果冷却速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液浓度提高，胞内水分大量渗出，导致细胞的强烈收缩和细胞处于高浓度的溶液中时间过长，从而造成化学损伤；如果冷却速度过快，胞内水分

12、来不及通过细胞膜向外渗出，胞内溶液过冷而结冰，从而造成物理损伤。同样，在复温（解冻）过程中，如果复温速率不当也可能引起细胞内结冰（重结冰）而损伤。,28,采用低温保护剂防止低温损伤：二甲基亚砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羟甲基淀粉（HES）等可以避免或减少结冰的程度与速度，降低细胞周围未冻结溶液中的电解质浓度，从而避免或减少胚胎冷冻过程中所发生的物理和化学损伤。,29,（二）胚胎冷冻保存技术的应用 1.应用于实验动物的保种和珍稀或濒危动物种质保存。应用于实验动物胚胎的长途运输。应用于实验动物的生物净化。应用于实验动物育种和野生动物的实验动物化。,30,第三节 动物体细

13、胞克隆技术,31,克隆（clone）的概念 克隆是指无性繁殖或拷贝。无性生殖在植物中很常见，在动物中过去认为是不可能的。动物克隆是指生物体通过体细胞核移植生产出基因型几乎与供体完全相同的后代。,32,核移植（Nuclear transfer）是指将动物细胞的细胞核移植到另一个体的去核卵母细胞胞质中，通过电激活，使供体核重编程序，形成的重构卵发育成胚胎，最后通过胚胎移植，使之发育成个体。如果受体去核卵和供体移入的核来自同种动物，则称种内核移植，来自不同的种则称为种间核移植。核移植由于没有经过精子和卵子的受精过程，核移植动物的全部遗传信息来自供体核细胞，等于是复制了提供细胞核的动物，因而把它俗称为

14、“克隆”。,33,根据供体核的来源不同，核移植包括以下几种：胚胎细胞核移植：未着床的囊胚（未分化）胚胎干细胞核移植（未分化）胎儿成纤维细胞：出生前的胎儿（未分化或低分化）成年体细胞（已分化）,34,动物克隆的实验过程,35,动物克隆技术的意义与应用,加快良种家畜的繁殖速度与体细胞转基因技术结合，能制备大家畜转基因动物拯救濒危野生动物治疗性克隆，用于再生医学,36,再生医学技术路线简介,37,第四节 干细胞技术,38,一、概述干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞。根据发育阶段，可将干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)和成体干细胞(adult

15、 stem cells，AS细胞)。ES细胞存在于囊胚期胚胎的内细胞团中，是全能性、无限增殖的干细胞，在胚胎的生长发育过程中具有分化形成胎儿所有类型细胞、组织和器官的潜能。AS细胞是ES细胞定植于胎儿和成人的各种组织和器官中的“种子”，具有自我更新和分化为组织特异细胞的能力，即分化为相应组织和器官中细胞的“专能”细胞，包括神经干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、精原干细胞、皮肤干细胞和肝脏干细胞等。,39,40,诱导性多潜能干细胞”(Induced pluripotent stem cells,iPS 细胞)2006 年,Takahashi 等首次发现导入特定的转录因子基因能够使已分

16、化的细胞重编程回归到胚胎细胞状态。他们通过慢病毒载体介导将Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 种转录因子基因导入小鼠皮肤成纤维细胞,获得了具有强大的自我更新能力和分化潜能的多能性干细胞,命名为“诱导性多潜能干细胞”(Induced pluripotent stem cells,iPS 细胞)。这一研究克服了ES细胞和AS细胞应用存在的诸多问题，展现了广阔的应用前景，受到了整个生命科学领域的广泛关注。目前研究中较为理想的供体细胞主要有血细胞(如T 细胞和B 细胞等)、脂肪细胞和皮肤成纤维细胞。,41,二、胚胎干细胞（ES细胞)来源：ES细胞是从胚胎发育早期囊胚（人胚胎受精后约5-7天

17、，小鼠胚胎受精后3-4天）中的内细胞群分离出来的未分化细胞。内细胞群:具有未分化特性，可进一步分裂,分化形成内、中、外三个胚层。外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群分离出来后在培养皿中培养时，我们称之为ES细胞。,42,目前除了从小鼠、大鼠和人分离得到并建立ES细胞系外，还未从其它动物的囊胚中分离到ES细胞系。,43,（二）ES细胞的培养 ES细胞的培养条件极其苛刻，对培养液、试剂、胎牛血清、水等均需采用胚胎级，对培养器皿等必须清洗干净。一旦条件不适合，E

18、S细胞容易发生分化，从而失去ES细胞的特性。未分化ES细胞的培养一般需要与用丝裂霉素处理过的成纤维细胞饲养层（Feeder cell）共培养，饲养层细胞为ES细胞提供细胞因子来维持其未分化状态。在培养液中加用白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）能更有效地维持未分化的ES细胞。,44,（三）ES细胞的鉴定 ES细胞是一种正常的胚胎性干细胞，具有正常的染色体核型和体内外分化的潜能。在建系之初需要对其核型、分化能力和细胞标志物进行鉴定 1核型 2体外分化试验 将ES细胞在无饲养层、低胎牛血清的培养液中悬浮培养，数天后形成胚样小体（embryoid bodie

19、s）的内皮样大型细胞团；向成纤维细胞、心肌细胞以及造血细胞的分化。3体内分化试验 将ES细胞悬液注射到同性别小鼠的腹股沟皮下，2周后注射部位出现肿块，病理检查为畸胎瘤。畸胎瘤内部有多种细胞生长，如上皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、成纤维细胞以及干细胞集落等，也可看到各胚层组织的分化，如软骨、肌肉组织、上皮组织及腺体等。4ES细胞的标志物 Oct-4:Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）属POU转录因子一员，它在全能胚胎干细胞(ES)和生殖细胞表达。该表达对于维持干细胞的自我更新和多能性是必要的。ES的分化导致Oct-4的下调。SSEAs:人ES细胞表达SSEA-3和SSEA-4，

20、但不表达SSEA-1。小鼠ES细胞表达SSEA-1，但不表达SSEA-3或SSEA-4。,45,（四）胚胎干细胞的应用1.用于研究哺乳动物个体的发生发育规律由于ES细胞可分化为胚胎内胚层、中胚层和外胚层中任何一种类型细胞，因此可用遗传标记的ES细胞(如标记半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通过组织化学染色追踪ES细胞的分化特点，探索胚胎发育过程中细胞分化、组织和器官形成的规律。小鼠的ES细胞已成为研究哺乳动物早期发育规律的重要工具之一。,46,2.在体外研究细胞的分化规律 ES细胞仅在饲养层细胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白细胞介素-6(IL-6)的培养液中维持不分化状态。当培养液中添加分化

21、诱导剂，如牛黄酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、丁酰环腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可诱导ES细胞发生不同类型的分化，通过研究ES的分化特点可揭示细胞分化和凋亡机理。,47,3.用于研究基因的功能和制备基因敲除动物 由于用ES细胞可进行基因打靶，容易获得基因敲除或定向插入外源基因的ES细胞，因此是基因敲除和基因插入的首选细胞。通过筛选获得阳性细胞，然后用嵌合体或细胞核移植技术获得转基因动物。用于研究未知基因的生物学功能。,48,4.治疗人类的某些难治性疾病 人类由于细胞坏死、退化或功能异常引起的疾病，如帕金森综合症、少年糖尿病和老年痴呆症等，已成为医学上尚未攻克的顽症。利用ES细胞可以诱导分

22、化形成新的组织 细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。目前，在动物实验方面，用ES细胞诱导分化出的某些组织细胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑难病症。,49,5.培育出人造组织器官，用于器官移植 随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官，解决目前临床上存在的供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。,50,三、成体干细胞1.成体干细胞（AS细胞）的来源AS细胞位于出生后体内分化成熟的组织之中，具有自我更新和分化潜能，它在分裂时可产生两个子代细胞，一个与原来干细胞完全一致，另一个向前分化，形成相应组织的多功能干细胞，通

23、过分化增殖和更新衰老细胞来构筑相应的器官，维持正常生理功能。现在可从骨髓和血液、胎盘、脐带、肌肉、大脑、皮肤、脂肪、滑膜等多种组织中获取各种多能干细胞。,51,2.AS细胞的培养和诱导定向分化取所要分离AS细胞的组织，用酶消化法分散细胞进行体外培养。再用各种技术从体外培养细胞中分离AS细胞，如用免疫磁珠分离系统分离乳腺AS细胞。同ES细胞一样，AS细胞的诱导定向分化需要细胞因子、激素等刺激，如IL-l、IL-11、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等。通常情况下，供体干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。然而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律，如神经外胚层来源的NSC能分化为中胚

24、层来源的细胞如肌细胞，肌肉干细胞会分化为各种血细胞系等。所有干细胞中，来源于骨髓的干细胞在多向性分化方面具有较大的潜能，分为造血干细胞(HSC)和骨髓间质干细胞(MSC)。,52,3.AS细胞的鉴定各种AS细胞都有自己的标记物，可利用标记物进行鉴定。4.AS细胞的应用疾病的替代治疗和移植治疗 如用造血干细胞治疗白血病，造血干细胞在体外诱导分化成心肌细胞来修复受损伤的心肌，治疗心力衰竭。骨髓来源干细胞及其他来源干细胞都可以分化得到成骨细胞，通过将细胞与支架材料结合后移植于骨骼受损部位，用于修复骨骼缺损。,53,四、诱导性多潜能干细胞1.iPS细胞的来源iPS 细胞建立的过程主要包括:分离和培养宿

25、主细胞；通过病毒介导或基因转染的方式将若干个多能性相关的基因（Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4）导入宿主细胞；将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,用ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养液中根据需要加入相应的小分子化合物，以促进重编程。2.iPS细胞的培养和诱导定向分化其培养条件和诱导定向分化的条件基本与ES细胞相同。3.iPS细胞的鉴定iPS 细胞的鉴定与ES细胞相同。,54,如何获得人ES细胞传统技术 1.用病人的皮肤细胞核移植到人去核卵母细胞人卵母细胞来源问题2.用病人的皮肤细胞核移植到动物去核卵母细胞伦理问题新技术1.用ES细胞特异转录基因导入人皮肤细胞，直接转化成诱导多能

26、干细胞（iPS）(2007年）安全问题2.miRNAs直接将皮肤细胞转化为iPS(2010年）,以病毒为载体，向老鼠的成纤维细胞中注入4个基因，将其改造为细胞，然后在此基础上培育出一个老鼠胚胎，再把它植入代孕实验鼠的体内。20天后，一只黑色的小老鼠出生。,55,4.iPS细胞的应用iPS 细胞与ES细胞相比,具有很多优势。iPS细胞的来源更方便、更丰富，可以通过有限的几个转录因子基因转染直接诱导各种不同动物的体细胞来获取多能性干细胞，而不需要通过ES细胞途径，克服了许多动物至今未分离出ES细胞的问题。iPS细胞的产生不需要早期胚胎或者其他配子的参与，克服了使用人胚胎进行实验的伦理问题，可见iP

27、S细胞必然成为未来相当长一段时间内的研究热点。目前,科学家们已经成功地从小鼠、大鼠、猕猴、猪和人的体细胞中诱导并获得iPS 细胞。,56,第五节 外源基因导入胚胎技术,57,将外源基因导入到胚胎内主要有以下几种方法：一、直接导入受精卵或早期胚胎内 显微注射法：在显微镜下利用玻璃显微注射针将外源DNA直接注入到受体的受精卵雄性原核内。逆转录病毒载体法：将外源基因克隆到逆转录病毒载体，感染受体细胞时，外源基因可整合到宿主细胞染色体内。用于转基因和基因治疗。精子载体法：将外源DNA与动物精子一起孵育，在体外受精过程中由精子将外源DNA带入卵内。,58,二、将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞，再将转染的

28、细胞作为供体核移植到去核卵母细胞，发育成胚胎。1.将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞：电穿孔法：细胞暴露于高电压时，细胞膜为高电压瞬时击穿，从而使外源DNA被摄入细胞中。脂质体法：脂质体是一种人造膜，将外源DNA装入脂质体，与培养细胞一起温育，即可将外源DNA导入受体细胞。基因枪法：DEAE-葡聚糖介导法：磷酸钙介导法：,59,2.带有外源基因的ES细胞通过崁合体技术进入囊胚胚胎嵌合是指将遗传上不同的两类胚胎或胚细胞组合起来，由此而发育形成的动物称为嵌合体动物。由于嵌合体动物是两类遗传背景不同的胚胎发育形成的，不同细胞群体互相嵌合构成了器官和组织，但嵌合体动物携带的两种遗传特性不能同时遗传给下一

29、代的同一个体。究竟哪一个亲本的遗传特性能遗传取决于该亲本的细胞是否在嵌合体动物体内分化成生殖细胞（精子或卵子）。分化成生殖细胞的亲本的遗传特性能传给后代。,60,嵌合体动物的制备：1.聚合法 用聚合法制作嵌合体动物，是将遗传上不同（例如毛色不同）的两个816细胞胚胎用物理方法聚合起来。2.注射法 注射法是将胚胎干细胞或其他胚细胞注入桑椹胚或囊胚腔中来制作嵌合体动物。,61,3.带有外源基因的体细胞通过克隆技术进入胚胎将带有外源基因的体细胞作为供体，通过核移植技术克隆到去核卵母细胞，在体外发育成囊胚，再移植到假孕动物的子宫中。出生后动物的基因型与供体的基因型完全一致。,62,外源基因进入细胞后的

30、命运 外源DNA进入细胞后有三种命运：1被胞内酶降解。2以游离状态存在。游离的未整合外源DNA只要有真核细胞能识别的启动子、编码基因以及poly(A)信号等，一般都能得到表达，但随着细胞衰老，表达力下降。这种表达不能传代，称为暂时表达。3整合到受体细胞染色体（只有少数）。整合到受体细胞基因组的外源基因，能随细胞分裂遗传到子细胞，称为稳定表达。,63,DNA构件导入细胞的方法,64,外源基因整合到受体细胞染色体可分为以下两种情况：随机插入（Random insertion）：外源基因进入细胞后，随机插入到任意的染色体内。如果插入到一个基因内，可能导致该基因的失活。另外，插入外源基因受邻近调控序列

31、的影响，其表达可能高，也可能低。定点整合（Targeted integration）：实现定点整合的前提是外源基因的一端或两端带有定点整合部位的同源DNA序列，即所谓的同源臂（Homologous arm）。当外源基因载体进入细胞后，同源臂序列与宿主染色体上的相同序列相互靠近，通过同源重组，将外源基因载体置换到染色体相应的位置上，实现了定点整合。我们把这种技术形象地称之为“基因打靶”。,65,随机整合（Random insertion）外源基因随机插入到染色体的任意部位。插入到致死基因序列内：胚胎死亡 插入到功能基因序列内：基因失活 插入到调控区下游：外源基因表达增强/减弱,66,定点整合（t

32、argeted integration）同义词：基因打靶（Gene targeting）是指将基因组的某一基因序列克隆出来并加以改造，再导入同种细胞内。该基因序列可以与细胞基因组内的同源序列（靶基因）发生重组，从而将改造后的基因置换到基因组内，实现靶基因敲除、替换或改造。,67,同源重组（Homologous recombination）是指发生在DNA同源序列之间的重组，其条件是两条DNA分子有相同序列部分，并且互相接近。,68,如何在体外筛选定点整合的供体细胞和ES细胞？采用正负筛选法 正筛选：用Neor基因（新霉素抗性基因）杀死没有Neor基因的细胞 负筛选：用tk基因（HSV胸腺激酶基

33、因）有tk基因的细胞可使培养液中 的Ganc转变成一种有毒物质使 细胞死亡。对通过正负筛选法筛选存活的细胞进行分子生物学鉴定，筛选出定点整合的细胞。,69,用正负筛选法筛选定点整合细胞 正筛选用Neor基因：新霉素抗性基因 当带有Neor基因的打靶载体转染细胞，未整合Neor基因的细胞被培养液中的G418（新霉素的衍生物）杀死，而整合到宿主细胞的Neor基因对培养液中的G418产生耐药性，存活下来形成细胞克隆。但是存活的细胞克隆只能证明是整合了Neor基因，而不能区分是随机整合还是定点整合。,70,负筛选用tk基因：HSV胸腺激酶基因 HSV-tk+基因产物可使培养液中的Ganc转变成一种有毒

34、物质使细胞死亡。如果发生随机整合，tk基因的作用是细胞死亡。如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，断裂脱落，因而对细胞没有影响。这样受体细胞抗G418有正选择作用，对Ganc无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的。,71,随机整合和定点整合的不同点,72,复习题,思考题请叙述超数排卵、体外受精、胚胎分割、胚胎培养、胚胎移植、胚胎冷冻保存的基本概念。什么叫干细胞？根据发育阶段，干细胞可分为哪两类？什么叫iPS?iPS的实际应用意义是什么？根据供体核的来源不同，细胞核移植包括哪几种？一般所说的“克隆”是指那一种？外源基因导入胚胎内主要有哪几种方法？什么叫随机插入，什么叫定点整合？叙述正负筛选法筛选定点整合细胞的机理。,