实验二显微镜的构造原理及使用方法.ppt

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1、实验二 普通光学显微镜的构造原理及使用方法几种特殊显微镜的构造原理及使用方法细胞形态结构与几种细胞器的观察,实验目的,熟悉普通光学显微镜的主要结构和基本性能。掌握低倍镜、高倍镜和油镜的正确使用方法。初步了解光学显微镜的维护方法。在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。,实验原理,详见讲义,几种特殊显微镜的使用,实验目的：了解相差显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜的原理、构造以及应范围广泛；掌握这几种显微镜基本的操作步骤。实验要求：了解普通光学显微镜的构造及其原理，并熟练掌握其操作方法。具备一定的物理学光学知识。,一、相差显微镜,实验原理：人的眼睛只能感觉光波的波长（颜色

2、）和振幅（亮度）的变化。活的细胞和未染色的标本多为无色透明，光波通过时，光波和振幅并不发生变化，因而，常采用固定和染色等各种理化措施，使被检物体的颜色和亮度发生变化，以利识别。另一方面，即使是近于无色透明的细胞和标本，各部分的折射率和厚度也会有微小的差异。当光波通过时，在各部分的滞留时间就会不同，即光程会有微小的不同，因而光波的相位会发生微小的变化。人眼不能识别相位的差异，但相差显微镜能够将相差变为振幅（明暗）差，从而使我们可以利用相差显微镜直接观察活细胞或未染色的标本的细微结构。,相差显微镜将相位差转变振幅差，是利用了光的衍射和干涉现象。光源射出的光线通过被检物体时，如果是完全均质透明的物体

3、，光线将继续沿直线前进，称为直射光；如果是含有折射率略有不同的物体，一部分仍为相位和振幅相同的直射光，另一部分由于光的衍射现象则向周围侧方分散前进，这种光称为衍射光。衍射光速度比衍射光大约低1/4波长。当直射光和衍射光同时到达一点时，两者相互干涉，形成合成波。合成波的大小取决于两个光波的振幅和相差。如果振幅相等，相差为零，即波峰与波峰相遇，其合成波则有两倍的振幅，产生的相长干涉（同向量），最为明亮。若一个光的相位推迟，其合成波减小，光度渐暗，当恰好推迟半个波长（1/2）时，即波峰与波谷相遇，则两个光波的振幅相互抵消，合成波发生相消干涉（异向量），则成为黑暗状态。在普通光学显微镜中，尽管光波通过

4、被检物体后也发生了衍射，直射光与衍射光也发生了干涉而形成合成波，但因衍射的速度比直射光大约低1/4（而不是1/2或0）波长，所以合成波的振幅与直射光的振幅相同，即被检物体与背景间不能形成明暗反差，我们很难看到被检物体。,若在直射光的通过点放置推年迟相位的物质，将直射光推迟1/4波长，使之与衍射光保持同一像相位，合成波等于直射波与衍射波振幅之合，振幅加大被检物体亮度提高。若同时在直射光的通过点放置吸收光的物质，则直射光的振幅减弱，致使仅由直射光照射的背底变暗，被检物体的亮度相对年进一步提高。相反，若在大部分衍射光的通过面放置推迟相位的物质，把衍射光推迟1/4波长，两者的相差变为1/2波长，合成波

5、的振幅等于两波的振幅差，这时，被检物体亮度低于周围介质。,下面介绍相差显微镜的构造：1.环状光阑：由大小不同的环状孔组成的光阑，与聚光器一起组成转盘聚光器。外面标有10 x，20 x，40 x，100 x字样，相应地与不同倍率的物镜配合使用。环状光阑的作用是将直射光所成的像与衍射光旁像分开。2.相板：安装在相差物镜后焦面上。相板分为两部分，即通过直射光的共轭面和通过衍射的补面。相板上镀有吸收膜和相位膜，以推迟直射光（衍射光的相位）并吸收直射光（或衍射光），从而使亮度发生变化。相板的种类很多，相差物镜种类的也很多。3.合轴调中望远镜：用以调整环状光阑所造成的像与相板共轭面完全吻合。相差显微镜在使

6、用时，聚光镜下面的环状光阑的光环，应与相差物镜中的相位相互吻合，完全一致，否则，直射光和衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能被吸收，相位该推迟的光波不能被推迟，失去相差显微镜的作用。由于环状光阑的光环与物镜相板的环孔甚小，为使二者相互对准，完全重合，必须使用合轴调中望远镜。,实验步骤,1.安装好环状光阑和相差物镜。2.在明视野条件下对光，调焦。3.拔出目镜，插入合轴望远镜，用左手指固定其外筒，一边看着望远镜，一边用右手转动内筒升降，对准焦点叫能看到环状光阑的亮环和相板黑环，将望远镜固定，升降聚光器并调节其下的螺旋，使亮环的大小与黑环一致，再旋转聚光器两侧的条调节钮，使光环和黑环完全重合。4.拔出

7、望远镜，插入目镜，即可观察。,注意事项：在更换不同倍率相差物镜和不同种类的相差板时，要重新合轴调中。使用油物镜时，聚光器上透镜表面与栽片之间要同时上镜油。,二、荧光显微镜,实验原理：荧光是荧光物质受光或其它射线时所发出的可见光，其特点是：吸收了能量即刻发光，光或其它射线停止照射时也叫立即停止发光。荧光分为两种：自发性荧光和继发性荧光。自发性荧光指动植物组织和细胞内的某些成分经短波照射后发出的微弱荧光；继发性荧光指某些细胞成分与荧光染料结合而在照射后呈现出的荧光。荧光染料的种类很多，并且对年各种被检物体表现出不同的亲和性。荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统，发出一定波长的光（紫

8、兰光42mm或紫外光365mm）做为激发光，激发标本的荧光物质使其发出荧光，再经过物镜和目镜的放大进行观察。荧光显微术是生物，医学中的重要研究手段，可以研究细胞内的自发荧光物质，更重要的是可以研究不同荧光探针标记后的细胞及其化学成分。,下面介绍荧光显微镜的构造：1.荧光光源：一般用超高压汞灯，它的紫外和紫兰部分有很强的发射。2.滤色系统：由激发滤光片和吸收滤光片组成。3.激发滤光片：提供一定波长的激发光。激发光的波长根据备激发的荧光物质而定。4.吸收滤光片：把不需要的激发光吸收掉而只让所需要的荧光通过，同时也保护眼睛不受激发光的影响。吸收滤光片必须与激发滤光片配合使用。,实验步骤,1.制备标本

9、：取蛙血作血涂片，注意涂片时使血滴位于两片栽片的夹角中，移动上面的栽片时，代动血液前进，而不能推进血滴。将涂片浸入甲醇中固定5min，然后再转入1/1000丫啶橙（荧光染料）水溶液中染色35min，水冲洗，干燥。2.打开荧光显微镜灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮。注意：超高压汞灯不能反复开关，点燃15min后才能关；关闭5min后才能开。汞灯开时，不能开室内照明灯。3镜检标本，可见红细胞的细胞核发橙色荧光，胞浆暗绿色，有时可见细胞核呈不规则的白细胞。注意：标本照射时间过长，会发生荧光减弱现象。,三、暗视野显微镜,实验原理：暗视野显微镜是以丁达尔现象（即光的微粒散射现象）为基础，利用特殊

10、的聚光器（如抛物面聚光器）进行斜射照明，它不让光柱自下面而上地通过标本，不让强度很大的光线直接进入物镜，到达观察者的眼睛。因此，我们在暗视野中所看到的既不是照明的光线，也不是标本本身，而是备检物体的衍射光图象。由于以上原因，暗视野显微镜只能看到物体的存在和运动，不能辩清物体的细微结构。但普通光镜的最大分辨率仅为0.2m，而在暗视野显微镜下，尽管看不清物体的细微结构的，却可以分辩小至0.004m，据此我们可以说暗视野显微镜的分辨率高于普通光镜。,下面介绍暗视野显微镜的构造：暗视野显微镜与普通光镜相比，在构造上的差别就在于用暗视野聚光器代替普通聚光器，并且所用的物镜的镜口率一般小于0.85，这样使

11、照明的线不进入物镜，造成暗视野。暗视野聚光器的种类很多，常见的为抛物面聚光器，这种聚光器的下面设有中央遮光板，以遮掉光源中部的光柱，只让边缘的筒状光柱通过，抛物面使筒状光束改变行走方向，呈斜射途径前进，会聚于标本的位置上，但不进入物镜，而标本散射出来的光进入物镜。,1.安装暗视野聚光器，并选用强光源。2.在聚光器和载玻片之间滴加香柏油，目的是防止照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，从而得不到暗视野照明。3.调节聚光器的焦点对准被检物。首先调节聚光器的中心，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格地在一条线上，然后操纵聚光器调节螺旋，使其升降，把焦点对准被检物体，以圆锥形光束顶点照射物体。4

12、.示范观察：示范观察变形虫装片及叶片栅栏细胞装片。暗视野显微镜在下观察活的动植物细胞，看不清内部的细微结构，只能观察到细胞，细胞器的轮功廓。尤如黑夜里看星星，在黑暗的背景里看到细胞所反射或衍射的光线形成的像。变形虫细胞内细胞质的流动及栅栏细胞内原生质的流动均可看到。,实验步骤,人血涂片细胞观察 分别用低倍镜和高倍镜观察血细胞的形态。洋葱根尖切片细胞的观察 先用低倍镜观察，寻找细胞形状规则、形态清晰的区域，换高倍镜观察细胞内部结构。马蛔虫受精卵切片中心体的观察,作业,为什么使用高倍镜和油镜时，必须从低倍镜开始？显微镜下看到的物像是正像还是反像？物像与玻片的移动方向是否一致？为什么？简述使用显微镜

13、的注意事项。绘制你所看见的各种细胞和细胞器，并标示出各部分（注意：细胞器外形特点、大小、分部、位置、数目）。,1.相差显微镜有哪些特有的附件？其构造如何？2.为什么相差显微镜可以直接观察活体样本？3.简述相差显微镜，荧光显微镜，暗视野显微镜的使用步骤。4.描述荧光显微镜下鸡（鹌鹑）血细胞显位微结构的荧光分布图。并结合荧光显微镜原理及其他相关知识，对此荧光现象作一分析。5.选用哺乳动物的红血细胞可否作类似的荧光观察。,参考文献：李宗锋.1997.在显微镜的使用中常见的错误。教学仪器与实验，（1）：1920章静波主编，1995。细胞生物学使用方法与技术。北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，225250,