培养细胞的观察和检测方法.ppt

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1、,WELCOME,培养细胞的观察检测方法,生物技术教研室 李延兰,活细胞的观察检测方法 培养细胞常用的染色方法 细胞生长状况有关指标的检测方法 细胞生物活性的有关化学检测方法 电子显微镜技术,一、活细胞的观察检测方法,肉眼观察 相差显微镜观察,细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。细胞常规检查的方法为：,肉眼观察,一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。,pH 颜色 透明度,正常 7.27.4 桃红色 清亮、透明酸性产物 变浅、变黄 污染 混浊,变黄 pH pH 变红,

2、大多数细胞适于在pH 7.27.4条件下生长，低于pH 6.8或高于pH 7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH 降低。为了维持培养基恒定的pH，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。若培养瓶、瓶塞漏气，使CO2溢出，或者由于洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，致使细胞难以生长，甚至死亡。,玻璃器材,常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、

3、培养瓶、培养皿、吸管、离心管。首次使用：重复使用的处理步骤：,显微镜观察,相差显微镜（phase contrast microscope）活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。20世纪30年代 荷兰 Zernike 原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。,相差显微镜观察活细胞的步骤如下：,调整好相差显微镜,观察瓶皿准备,调光,调焦与摄影,细胞观察,生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。若细

4、胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。,显微镜观察,细胞的生长状态,BMSCs,培养细胞的生长过程,各种细胞及各代细胞增殖的时间不尽相同。原代细胞、成体组织的潜伏期较长，24h后仅见到部分细胞开始贴壁，912d长满瓶底，细胞融合呈交叉重叠生长。传代细胞系、胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期、对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮

5、细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。,Anip973,注意事项,标准化生产的培养板、培养瓶或皿一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。准备观察的瓶、皿要平坦，质地均匀，透光度好，在观察前将培养瓶、皿面擦净。天气较冷时，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。对原代细胞培养进行相差显微照相，应在换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度。观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈震荡；观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。,显微镜观察,活细胞

6、的观察检测方法,暗视野显微镜技术观察活细胞 缩时显微镜摄影观察 体外活细胞染色观察,暗视野显微镜技术观察活细胞（dark field microscope)原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。缩时显微摄影术观察（time-lapse cinemicrophotagraphy，TLCM）优点：可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。缺点：较

7、昂贵,体外活细胞染色观察,体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。,碱性染料酸性染料（台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）,活体染料,噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胺蓝）恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油紫）丫嗪类（中性红、詹纳斯绿）三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）,中性红染色 常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。结晶紫染色

8、 使用浓度为0.1，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。台盼蓝染色 用0.5浓度的台盼蓝（trypan blue)，用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。,E.coli 以结晶紫(crystal violet)染色,B.cereus以石炭酸复红(carbol fuchsin)染色,aureus 以甲烯蓝(methylene blue)染色,二、培养细胞常用的染色方法,细胞固定的基本方法 细胞常用的染色方法 细胞特殊的染色方法,1、细胞固定的基本方法,固定组织、细胞的目的：把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避

9、免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等；同时，固定还可以使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。固定组织、细胞的原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。,固定前的准备：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。悬浮细胞：离心（8001000r/min）PBS/Hanks漂洗23次 贴壁细胞：用镊子轻轻取出盖片PBS/Hanks漂洗23次注：漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。,常用固定液,简单固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等混合固定液：甲醇

10、/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4多聚甲醛-PBS固定液等甲醇/醋酸固定液：甲醇：冰醋酸为3：1，现用现配，适用于Giemsa染色。FAA固定液：90mL 80酒精5mL 冰乙酸5mL 40甲醛，适用于盖片单层培养的细胞，固定效果好。Carnoy固定液：较好的非水溶性固定液，60mL 纯酒精30mL 氯仿10mL 冰乙酸，适用于显示细胞化学成分。,2、细胞常用的染色方法,H.E（苏木精-伊红）染色法原理：碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞的图像，并能提供良好的核浆对

11、比染色。染液配制：染色步骤：染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。,Giemsa（吉姆萨）染色法,母液配制：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余甘油混在一起，56保温2h后，加入33mL纯甲醇，混匀，即为Giemsa母液，保存于棕色瓶内。染液配制：取9份pH6.87.38的Sorensen缓冲液和1份Giemsa母液混合即可。染色步骤：细胞标本用甲醇/醋酸固定液固定30min后，用滴管把染液布满玻片上，染色1015min，用自来水冲去多余染液，空气干燥，二甲苯同名，光学树脂封固。染色结果：细胞核染成红色，细胞质染

12、成蓝色。注意事项：染液宜现配现用，保存时间最好不用超过48h，Giemsa对pH极敏感，缓冲液pH要调准确。,3、细胞特殊的染色方法,Feulgen染色法 Coomassie染色法 PAS反应法 油红O（oil red O）法 免疫荧光染色法 免疫酶染色法,Feulgen（福尔根）染色法,原理：在60条件下，DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/L 盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff）试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中，RNA不受影响，故染色具DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水温、时间是成功的关键。水温过度或不足均降低染色强度。此法能对DNA 进

13、行特异性染色 试剂配制：1mol/L HCL：浓HCL 8.5ml 蒸馏水 91.5ml Schiff试剂：母液装入棕色瓶，盖紧，黑纸包裹置于暗处 染色过程：选用Carnoy固定液 染色结果：细胞核染成粉红色至紫红色，胞质为无色。,考马斯亮蓝（Coomassie，BB）染色法,原理：显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法试剂配制：固定液：0.1mol/L NaH2PO42H2O 14.0mL 0.1mol/L Na2HPO412H2O 36.0mL蒸馏水50.9mL25戊二醛50.0mL染色液：甲醇46.5mL冰醋酸7.0mL考马斯亮蓝0.02g染色过程：染色结构：细胞内的微丝呈现蓝色。,过碘酸席

14、夫反应法（periodic acid Schiff reaction，PAS）,原理：过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成两个游离的醛基，它们与Schiff试剂反应生成紫红色产物。细胞内糖类的染色方法 试剂配制：染色过程：染色结果：细胞含糖原区呈紫红色。,细胞内脂类的染色方法,苏丹（Sudan）/法 苏丹黑法 Lillie油红O（oil red O）法 Cain硫酸尼罗蓝（Nile）法 锇酸（osmic acid）法,油红O（oil red O）法,优点：油红O染色的脂肪比苏丹法染的颜色要深，对微小的脂滴易于显示，而且沉淀较少。10中性甲醛溶液的配制pH 7.

15、0：量取3740甲醛20mL，蒸馏水180mL，加入0.8g 磷酸二氢钠NaH2PO4H2O、1.3g 磷酸氢二钠Na2HPO4，配制成200mL 10中性甲醛溶液，密封备用。,免疫荧光染色法 原理：将已知抗体或抗原标记荧光素，用此特异性试剂，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本，借助抗原抗体的特异性结合，于抗原或抗体的存在部位呈现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。免疫酶染色法 原理：ABC免疫酶染色法即卵白素-生物素-酶复合物法，是目前最敏感的免疫细胞化学染色法之一。其基本原理是将特异性第一抗体与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素化桥抗体与第一抗体结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性将生

16、物素化辣根过氧化酶连接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。,三、细胞生长状况有关指标的检测方法,细胞计数法 细胞生长曲线 细胞分裂指数 克隆形成率,1、细胞计数法,细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度。台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。注：台盼蓝染色排除检测法，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入却不能被排出，因而细胞被染色；而活细胞能排出细胞内的染料，因而不易着色。,Trypan blue staining of adult rat cardiac myocytes in primary culture.Live cells

17、exclude the blue dye,and so appear clear.Dead cells take up the dye and appear blue.,结果分析细胞密度 细胞数/ml（4大格细胞数之和/4）104稀释倍数细胞存活百分率 细胞活力（）未着色细胞数总细胞数100,2、细胞生长曲线,细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是观察同一代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲线分析细胞增殖方法一：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数为纵坐标，即为该细胞的生长曲线。方法二：四氮唑盐（MTT）比

18、色法,3、细胞分裂指数,细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标；以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。方法：染色后血细胞计数板计数 细胞分裂指数细胞分裂相数/细胞总数（1000）100,4、克隆形成率,克隆形成率所计数的细胞必为贴壁和有增殖能力的细胞，反映细胞群体依赖性和增殖能力。各种细胞克隆形成率差别很大，一般初代细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。方法 克隆形成率克隆数/接种细胞数100注意：细胞要分散好，不能有细胞团，接种密度不要过大。,四、细胞生物活性的化学检测法,四氮唑盐（MTT）比色法 细胞蛋白质含量测定法

19、细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入试验 细胞DNA合成的3H-TdR掺入试验,1、四氮唑盐（MTT）比色法,原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积于细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS等均能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪，在490nm波长处测定其光吸收值（OD），可间接反映活细胞数量。在一定细胞数值范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。此法已广泛用于生物活性因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定等。,2、细胞蛋白质含量测定法（考马斯亮蓝测定法）,原理：考马斯亮蓝在酸

20、性溶液与蛋白质结合后，在595nm波长处呈现最大吸收量，其吸光值与蛋白质含量呈正相关。此法主要用于测定酶、受体及细胞外代谢产物特异性活性的度量单位。,3、细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入试验,原理：细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨基酸，用核素标记氨基酸，如3H-亮氨酸，可以掺入细胞蛋白质合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢状况。,4、细胞DNA合成的3H-TdR掺入试验,原理：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用核苷3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。,五、电子显微镜技术,光学显微镜 0.2m电子显微镜 0.2 n m,透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）,中幼红细胞透射电镜,血小板纵切面透射电镜,谢 谢,The End,