土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(已用).ppt
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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,专题2微生物的培养与应用,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、本课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,1、实例:,启示:寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。,原因:因为热泉温度70800C,淘汰了绝大多数微生物只有耐热的Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术,此项技术
2、要求使用耐高温(930C)的DNA聚合酶。,一、研究思路,筛选菌株,统计菌落数目,设置对照,要分离一种微生物,必须根据该微生物的特点,包括营养、生理、生长条件等;方法:抑制大多数微生物的生长 造成有利于该菌生长的环境结果:培养一定时间后,该菌数量上升,再通过平板划线法或稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理:,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物生长。,选择培养基:在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:,在此培养基中哪
3、些作为碳源、氮源?,碳源:葡萄糖、尿素 氮源:尿素,思考1,从物理性质看此培养基属于 培养基,是由于加入了凝固剂。从功能上看属于 培养基,此培养基的 只有尿素,能利用尿素的微生物可分泌脲酶,因此能在此培养基上生长,此培养基属于 培养基。,思考2该培养基对微生物(具有,不具有)选择作用。如果具有,其选择机制是。,具有,只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长,选择,固体,琼脂,选择,氮源,思考3,培养基的氮源为尿素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,而受到抑制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,
4、4、培养基选择分解尿素的微生物的原理,活学活用,1.在缺乏氮源的培养基上,大部分微生物无法生长;在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长;在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出()A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C.固氮细菌、霉菌、放线菌D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌,C,(1)原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。(2)常用方法:稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中,C
5、代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml),M代表稀释倍数。,(二)统计菌落数目:,1.活菌计数法,(3)计算公式:,(间接计数法),想一想,如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数?,统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好能统计3个平板,计算出平板上的菌落数的平均值,然后按以下公式进行计算。,旁栏思考题,每克样品中的菌落数(CV)M其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml),M代表稀释倍数。,实例分析P22,第二位同学的统计结果更接近真实值。因为第一位同学只涂布了一个平板,没有设置重复组,因此结果不具
6、有说服力。,你认为哪个同学的结果更接近真实值?,你认为这两位同学的实验需要改进吗?如果需要,如何改进?,都需要。第一位同学在该浓度下可以多涂布几个平板;第二位同学考虑到设置重复组的问题,涂布了三个平板,但是其中1个平板的计数结果与另外2个相差太远,说明在操作过程中可能出现了错误,因此,不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值,可以在该浓度下重新进行实验。,注意事项为了保证结果准确,一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布三个或三个以上的平板,培养统计菌落数,计算出菌落平均值。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键,一般以
7、三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右时为最好。,2、显微镜直接计数:,利用血球计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,(二).统计菌落数目:,不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度;个体小的细菌在显微镜下难以观察;,缺点,将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1:1均匀混合,在显微镜下数出各自的数目,然后求菌液中的细胞数目。,(比例计数法,类似与标志重捕法),待测样品,等量的已知含量的红细胞,混匀,涂抹,测定:,计算单位体积内的细菌数目,【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。,举例:已知红细胞浓度为M个/mL,从体积为N mL的大
8、肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液等量均匀混合后,涂片,染色,镜检。在同一视野中发出有红细胞W个,大肠杆菌Y个,求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少?,观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数红细胞含量/细菌含量(类似于标志重捕法),公 式,W/Y M/X(每mL中),NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X为:,2.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数,最接近样品中菌体数真实值的是()A.菌落数量最多的平板B.菌落数量最少的平板C.菌落数量适中的平板D.取若干个平板菌落数量的平均值,D,活学活用,设置对照的主要目的是排除实验组
9、中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。,(三)设置对照:,设置对照的方法:空白对照:不给对照组任何处理因素;条件对照:给对照组施以部分实验因素,但不是所要研究的处理因素;自身对照:对照组和实验组都在同一研究对象上进行;相互对照:不单设对照组,而是几个实验组相互对照。,教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同,可能的解释有两种:一是由于土样不同;二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因?方案一:其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致,则证明A同学操作无误;如果结果不同,则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实例:教材P23,教材提供的
10、案例中A同学的结果与其他同学不同,可能的解释有两种:一是由于土样不同;二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因?方案二:将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养,作为空白对照,以证明培养基是否受到污染。,实例:教材P23,小结:通过这个事例可以看出,实验结果要有说服力,对照实验的设置是必不可少的。,9,实验设计:,实验设计包括对实验方案,所需仪器、材料、用具和药品,具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。,二实验设计与操作,下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图,请结合教材提供的资料,进行实验设计,并写出详细的实验方案:,实验设计:,实验方案:,(一)土
11、壤取样,(三)样品的稀释,(四)取样涂布,(五)微生物的培养与观察并计数,(六)鉴定,实验的具体操作,(二)制备培养基:,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度。原因:不同微生物在土壤中含量不同。目的:保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。,(三)样品的稀释,特别注意的几个具体操作,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度?,土壤中各类微生物的数量(单位:株/kg)是不同的。,测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围相同吗?,为获得不同类型的微生物,就需要按不同的稀释度进行分离,同时还应
12、当有针对性地提供选择培养的条件。,旁栏思考题,保证获得菌落数在30300的平板进行计数。,稀释度,(四)取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进行菌落的计数,如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大,表明试验不精确,需要重新实验。,特别注意的几个具体操作,3.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述,其中错误的是()A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基,经高温、高压灭菌后倒平板。B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL,分别涂布于各组平板上
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- 土壤 分解 尿素 细菌 分离 计数
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