南农生物分离工程生物分离.ppt

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1、Ion exchange chromatography,R+A-+B-R+B-+A-,原理是依据物质所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来,沸石软化硬水 1935合成酚醛系磺酸型离交树脂60年代大孔型树脂 离交纤维素,离子交换剂的结构组成是一种含有多元酸或多元碱为功能基团的多孔网状立体结构的固相物单元结构：多孔网状立体结构的骨架 不可移动部分 功能基团 可移动部分,离子交换剂的分类,无机物沸石、磷酸钙凝胶1)骨架组成 疏水性骨架树脂类 有机物 多糖类 亲水性骨架 有机聚合物树脂类（苯乙烯类、酚醛类等）

2、多糖类（葡聚糖、琼脂糖、纤维素等）有机聚合物（聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等）,微孔型（凝胶型）2)骨架结构 大孔型 均孔型 酸性基团 阳离子（强、弱）3)功能基团 碱性基团阴离子（强、弱）两性,离子交换层析法,离子交换过程,离子交换：RA+B+=RB+A+洗脱：RB+C+=RC+B+再生：RC+A+=RA+C+,离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化。,树脂类型,阳离子交换树脂:含酸性活性基团的树脂。强酸型：RSO3H pH 0-14 不受酸度限制,弱酸型：RCOOH pH4 ROH pH9.5 选择性好,可分离各种有机碱及氨基酸

3、,强碱型：R N(CH3)3Cl pH 0-14弱碱型：R NH2，RNHCH3 pH 0-7 RN(CH3)2 pH 9.5,阴离子交换树脂:含碱性活性基团的树脂,724弱酸型,两性树脂 热再生树脂 脱盐20-25 再生70-80 RCOOH+RNR2+NaCl=RCOONa+RNR2HCl 螯合树脂：含有特殊的螯合活性基团,蛋白质通常以离子键吸附，因此要洗脱蛋白质时，必须提高盐浓度以破坏之，大多使用 NaCl；蛋白质吸附在担体上的强弱程度，会影响洗脱所需使用的盐浓度，结合越紧的分子，要使用越高的盐浓度。也可以改变洗脱缓冲液的 pH，使得蛋白质的电荷改变而洗脱出来，一般多使用前者。,所使用缓

4、冲液的 pH 不要离目标蛋白质的 pI 太远，否则目标蛋白质带了太强的净电荷，会很强地吸附在离子交换介质上，就必须使用较为剧烈的洗脱条件，可能对蛋白质有所伤害。,阳离子交换分离（0.1molL-1 HCl为淋洗液）,亲和力大的先被交换上去,后被洗脱下来.,离子交换树脂的命名,微孔（普通）型离子交换树脂 ABCM大孔离子交换树脂 DABC 其中：A分类代号 B骨架代号 C产品顺序号 M交联度,强酸 001-100 弱酸101-200 强碱 201-300 弱碱301-400 中强酸401-500 交联度=交联剂/（单体+交联剂）100%,国内外离子交换树脂相应牌号对照724=1014 弱酸717

5、=2017 强碱732=0017 强酸711=2014 HD42=001Amberlite IR系列Zerolit 系列 神胶系列,离子交换树脂的制备,一般制备过程骨架的合成：加聚法 或 缩聚法+交联功能基团的引入：化学反应偶联引入功能基团；单体本身含有功能基团,离子交换过程R-B+A+=R-A+B+1.溶液树脂表面“膜扩散”限制2.树脂表面交换中心“粒子扩散”限制(蛋白质大分子）3.A+、B+交换快4.5.逆过程,影响因素 粒度 交换速度 搅拌速度 交换速度3.交联度 4.离子半径、离子价 5.温度 6.离子浓度,离子交换动力学原来树脂上离子2，通入离子1取代“交换带”逐渐变窄，离子逐渐分层

6、“漏出点”B影响因素：吸附力 A1浓度大 交换带宽 柱床流速交换速度 交换带宽,离子交换树脂的性能,要求 交换容量大 2.选择性好化学性质稳定 4.化学动力学性能好物理性能好,影响因素功能基团的数目、种类 交联度 骨架、平衡离子,主要理化常数测定 含水量 g/g干树脂 烘干法 交联度 含水量 活性基团亲水性、数量 膨胀度 K膨胀 功能基团亲水性、数量，活性离子价，同价离子，半径，骨架结构影响,湿真密度 R=树脂湿重/排出同体积水重 功能基团，湿视比重=树脂湿重/外观容积,交换容量,是表征交换剂离子交换能力的主要参数。(exchange capacity)mmol/g干树脂；mmol/ml湿树脂

7、 与功能基团、pH有关,交换容量的测定,对于阳离子交换剂：用HCl将其处理成氢型，称重并测定其含水量；称数克交换剂，加入到过量已知浓度的NaOH溶液，发生交换反应，待反应达到平衡后(强酸性的需要静置24h，弱酸性的需静置数日)，测定剩余的NaOH摩尔数，就可求得阳离子交换剂的交换容量。,对于阴离子交换剂：将阴离子交换剂转换成Cl型后，取一定量的Cl型交换剂，通入Na2SO4,用铬酸钾作指示剂，用硝酸银溶液滴定流出液的Cl-，根据Cl-量计算交换容量。,蛋白质的交换容量：比小分子化合物要小的多。树脂孔道的空间排阻作用大；交换后排阻其他蛋白质的扩散和交换；蛋白质的多电荷与多个交换中心结合,滴定曲线

8、,全面评价表征交换剂的重要参数方法：1g氢型(或羟型)树脂+x-ml 0.1M NaOH/or HCl+0.1 M NaCl至50 ml(其中1支+50 ml 0.1 M NaCl)+静置24h(对强交换剂)/or 7d(对弱交换剂)+测pH+作图,意义：,强离子交换剂的交换；弱离子交换剂的交换；滴定曲线的转折点确定交换容量；转折点数确定交换基团的种类数；交换容量随pH的变化。,离子交换的选择性,在稀溶液中，离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。,交换环境的影响 pH 对强树脂，影响交换离子的解离度 弱 交换离子和树脂的解离度 蛋白

9、质、酶等少用强树脂，影响选择性，不易洗脱，弱树脂可控，洗脱温和离子强度 低离子强度有机溶剂 降低有机分子解离度，树脂倾向于吸附无机离子,交联度 交联度大、结构紧密、膨胀度小、筛分能力大，选择性大。（无机离子）大分子复杂 K膨胀小，空间效应主要 K膨胀大，选择性主要 交联度不能过大 离子筛：链霉素、庆大霉素除Ca2+Mg2+灰分,辅助力 氢键、范德华力（交换离子是有机离子）无机离子K 1-10 有机离子102-103 土霉素对H+K1200功能基团的特殊亲和力 羧酸型树脂对Ca2+Cu2+Ni2+,偶极离子的排斥作用RSO3-Na+H3+NRCHCOO-=RSO3-H3+NRCHCOO-+Na+

10、RSO3-H+H3+NRCHCOO-=RSO3-H3+NRCHCOOHH型没有排斥力，对AA吸附量AA烃基链加长，排斥力丙酮中，羧基解离被抑制，H型 Na型对AA交换量接近AA脱盐：通过Na型强酸，无机离子被吸附,离子交换操作技术,树脂的选择和处理装柱交换洗脱树脂再生,树脂的选择 目的物较强碱、酸性，宜用弱酸、弱碱性树脂 弱酸、弱碱性，强碱、强酸性（AA）蛋白、酶等，弱酸、弱碱性孔径 树脂有化学稳定性、机械性能,处理和再生 外观与粒度球型，直径为（约16-70目）,2.预处理物理处理：过筛、水洗、酒精等浸泡化学处理：8-10倍1mol/LHCl NaOH交替浸泡4h 732分离AA，酸-碱-酸

11、（转型）碱-酸-碱 得Na型阴树脂：最后用 NaOH处理得羟型，用HCl得氯型生物大分子：转型后相应缓冲液平衡数小时 新3遍，旧2遍,再生、转型、毒化,再生：大量水处理（物理吸附）酸一次，碱一次转型：弱酸或弱碱树脂用碱（NaOH）或酸（HCl）强酸或强碱树脂用碱、酸，相应盐（NaCl）毒化：堵塞孔隙、活性基团脱落、生成不可逆化合物 常规处理，酸碱加热（40-50）有机溶剂加热，酶,化学稳定性阳阴（同种骨架）苯乙烯酚醛丙烯酸型M（金属）H型 氯型羟型大孔凝胶 交联度大交联度小,基本操作方法方式静态：分批，不适宜多种成分分离动态：柱分离，多组分洗脱 动态、静态酸、碱洗脱液改变电荷盐类 高浓度同种电

12、荷离子竞争,返回,离子交换层析的基本操作,层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍,平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要,离子交换层析的基本操作,样品进柱,为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%,为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高,交换过程,洗脱过程,离子交换层析的基本操作,样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH值,大孔、均孔树脂,凝胶型（微孔型）孔径3nm 孔隙率、表面积低 亲水性，呈溶

13、胀状态，失水后孔隙消失，非水介质中没有交换能力,大孔型离交树脂 加不参加反应的填充剂（致孔剂 高级醇类），后用有机溶媒溶出 与交联度致孔剂种类有关 特征：交联度高 孔径大（大分子）、交换速度快、“永 久性孔隙”、非水溶胀下使用、表面积大 孔隙率大、比重小均孔型 阴树脂、凝胶型,亲水性离子交换剂,特点亲水性骨架孔度大电荷密度小,亲水性离子交换剂,2）分类 多糖凝胶类（葡聚糖、琼脂糖、纤维素）骨架组成（Sephadex、Sepharose、Sephacel等）有机聚合物（聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等）(Toyopearl、Biogel-P),酸性基团 阳离子（强、弱）功能基团（磺丙基SP、羧甲基 CM）

14、碱性基团阴离子（强、弱）（季胺乙基QAE、二乙胺基乙基DEAE）,命名,功能基团+骨架组成如 DEAE-Sepharose、SP-Sephacel DEAE Sephadex A 50、CM Sephadex C 75、DE 52、CM Bio-Gel A,离子交换纤维素：,是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，交换基团稀疏、吸附弱，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。,阳离子型包括羧甲基纤维素（CM纤维素）等阴离子型包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）CM-C 弱酸型：-O-CH2COO-，适于中、碱性蛋白 PH4

15、使用，PK3.6 DEAE-C 强碱型：-O-(CH2)2N+H(C2H5)2 适于中、酸性蛋白 PH8.6使用，,制备,CM-C：-OH（NaOH)-ONa(二氯乙酸交联，一氯乙酸引入羧甲基)-O-CH2COOH DEAE-C：-ONa(C2H5)2N-CH2CH2OH+SOCl2,选择 酸性蛋白 pI5，用DEAE-C pH5.5-9.0 碱性蛋白 pI8，用 考虑目的物稳定性、杂质,解吸 洗脱缓和，改变pH、IC-OCH2COO-H3N+P OH-C-OCH2COO-+H2NP+H2O H+C-OCH2COOH+H3N+P NaCl C-OCH2COO-Na+H3N+P+Cl-,处理和再

16、生,水浸泡，充分溶胀，用数十倍低浓度0.5mol/l HCl 和NaOH反复浸泡（0.3-1h)平衡离子、缓冲液平衡 不耐酸、碱处理阳离子纤维素膨胀大,离子交换葡聚糖：,是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G）,常用的离子交换葡聚糖包括：,阳离子交换剂CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50,Sephadex C-25，Sephadex C-50 25-吸液量10倍,阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50,QAE-Sephadex A-25，QAE-S

17、ephadex A-50,Sephadex的优点：,亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快既有离子交换作用，又有分子筛效应,离子交换琼脂糖：,是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B,DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点,尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积,离子交换介质的选择原则,一般而言：,酸性物质用阴离子交换剂分离,氨

18、基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择,碱性物质用阳离子交换剂分离,离子交换介质的选择原则,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋白质净电荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH pI（-）,对pI=5的某酸性蛋白质,在的范围内，,当蛋白质为阴离子时，,应首选DEAE纤维素；,在的范围内，,当蛋白质为阳离子时，,应首选CM纤维素,离子交换剂与操作条件的选择,离子交换剂的选择 疏水性树脂类种类 亲水性凝胶类 小分子：无机离子、生物小分子 离子交换物 大分子：蛋白、酶、核酸、多糖,酸性（阳）强、弱功能基团性质 碱性（阴）强、弱 交联度及离

19、子交换容量稳定性,2）操作条件的选择,介质的pH值（离子交换剂的离解度、离子交换物质的离解度及其稳定性）离子交换剂的离子形式阳离子（H+、Na+、K+、NH4+）阴离子（OH-、Cl-、SO4 2-、CO3 2-）,淋洗剂水、低离子强度缓冲液 改变pH值洗脱剂 增加离子强度 或+缓冲液 有机溶剂,再生（转型）：疏水性树脂类：1.02.0 M 酸、碱（HCl、NaOH）亲水性凝胶类：0.10.5 M 酸、碱（HCl、NaOH）,“中毒”树脂类常采用的处理方法 4050的 2.0 M 强酸、强碱 10%NaCl+1-2%NaOH混合剂 有机溶剂混合液,离子交换法的应用,软水和去离子水的制备水的软化机理RNa+Ca2+、Mg 2+=RCa2+、Mg2+Na+去离子水的制备原理RH+ROH-+MeX=RMe+RX-+H2O,氨基酸的分离(阳离子交换树脂),用pH递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱侧链pKa增大的氨基酸,蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的 分离、纯化和富集.,1 离子交换树脂的分类？2 简述亲水性离子交换剂的特点。3 如何测定离子交换树脂的交换容量？,