凝胶色谱、亲和色谱研究进展及案例.ppt

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1、主讲人：College of Food Science,SCAU,修德,博学,求实,创新,凝胶、亲和色谱,目录,近期中国色谱研究进展中国色谱研究进展中国色谱最新动态凝胶、亲和色谱案例分析凝胶过滤色谱亲和色谱,一、近期中国色谱研究进展,文章名：近年中国色谱研究进展作者：张祥民1、张丽华2、张玉奎2（2003年院士）作者单位：1.复旦大学 2.中科院大连化物所发表期刊：色谱发表时间：2012年文章名：近期色谱研究的最新动态和进展作者：白泉作者单位：西北大学发表期刊：色谱发表时间：2015年,1、中国色谱发展概况,色谱归属于分析化学中的一个分支，其出现及发展至今已将近 110 年。色谱技术在生物制药

2、、蛋白质组学、生物分子的分离分析方面都发挥着越来越重要的作用。20 世纪末至今，是中国色谱学科全面快速发展的重要时期。Web of Science 数据库和“中国期刊全文数据库”和“万方数据库”的检索数据(2011 年9 月25 日检索)表明，1990 年至2010 年我国科技工作者在美国科学情报研究所科学引文索引收录期刊(即 SCI 期刊)和中国科技期刊上发表色谱相 关 论 文 132604 篇(其 中 SCI 期 刊 论 文27381 篇，中国科技期刊数据库论文 105223 篇)。,色谱方法应用于化学领域的论文数量占46%，生物化学与分子生物学领域的占 21%，食品科学与技术领域的占 5

3、%，材料科学、工程学、微生物学领域的各占 4%，环境科学、光谱学和药理学领域的各占 3%，上述领域之外的论文比例为 8%。1990 年至 2010 年，中国科学家所发表的色谱领域论文总数以 28062 篇的数量居世界第三位(第一名:美国，71008 篇;第二名:日本，35 035 篇)。2010 年发表论文 4146 篇，2011 年发表 4574 篇，排名跃居世界第一。,涉及毛细管电泳（CE）、气象色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）论文增长态势,2、最新动态,样品前处理膜蛋白的疏水性强、溶解性差和丰度低，对它的分离分析是蛋白质组学中的一大难题。复旦大学的刘宝红教授课题组采用壳聚糖改性的介孔

4、泡沫石墨烯(MGF-CS)作为纳米反应器，从有机溶剂中高效富集疏水性膜蛋白并进行原位酶解。将该技术应用于实际样品中膜蛋白的分析鉴定，采用二维液相色谱质谱方法(2D-LC-MS)可鉴定 931种膜蛋白，而通常采用的水溶液中酶解法仅能鉴定 73种膜蛋白。结果表明多功能的MGF-CS对蛋白质组学中膜蛋白的分析鉴定具有重要的应用价值。分子印迹技术是采用人工合成方法制备对目标分子有特异性识别材料的技术。由于蛋白质体积大、结构复杂、易于变性，完整蛋白质模板分子难以获得且价格昂贵，因此限制了蛋白质分子印迹材料的发展。中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员课题组提出了一种蛋白质抗原决定基分子印迹磁性纳米材料

5、的制备新方法。抗原决定基印迹是以目标蛋白质上一段特异性多肽为模板分子进行印迹。由于模板肽段与目标蛋白质间存在极强的特异性，形成的印迹位点对模板肽段及目标蛋白质均具有特异性识别能力。,金属有机骨架化合物（MOFs）因具有比表面积大、结构多样性、孔道尺寸可调、骨架可修饰、热稳定性和化学稳定性良好等优点而广泛应用于分离分析等领域。西班牙Balearic Islands大学的 Palomino课题组利用注射器设计了一种针管式自动磁性（MOFs）分散固相微萃取装置。固定相多孔整体材料作为一种新型分离介质，由于其具有制备简便、通透性好、性能稳定和易于修饰等特点而被誉为第四代色谱分离介质。邹汉法课题组发展了

6、一种基于光引发巯基丙烯酸酯点击聚合反应的新方法，并成功制备了具有高分离性能的有机硅胶杂化整体柱。与巯基烯和巯基甲基丙烯酸酯点击聚合反应相似，光引发的巯基丙烯酸酯点击聚合反应不仅反应效率较高，速度快，而且反应条件非常温和。加拿大卡尔加里大学的Thurbide小组将316不锈钢粉末（粒径44149m）填充于316不锈钢毛细管柱内作为支持体，将水泵入色谱柱中，建立了以水为固定相，CO2为流动相，与火焰离子化检测器联用的超临界流体色谱分离体系（SFC-FID）。,手性拆分德国莱比锡城大学的 Belder小组将纤维素-三（3，5二甲基苯基氨基甲酸酯）包覆的 5m全多孔SiO2手性固定相填充于微流控芯片的

7、通道中，第一次利用填充的微流控芯片（柱长58.4mm）实现了几种手性药物的快速拆分，对力莫敌提取物在 5s内就可完成拆分。分析检测澳大利亚悉尼大学的 Handelsman小组采用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯作为雌激素衍生化试剂，建立了一种利用LC-MS/MS同时测定血清中衍生化的雌二醇(E2)和未衍生化的睾酮(T)、二氢睾酮(DHT)的高灵敏检测方法。蛋白质组学美国 Wisconsin-Madison大学的Ge小组耦合离子交换色谱/疏水色谱/反相色谱(IEC-HIC-RPC)3种色谱分离方法，构建了三维液相色谱(3D LC)用于整体蛋白质的分离，并证明 3D LC(IEC-HIC-RPC)技

8、术优于传统的 2D LC(IEC-RPC)。,二、凝胶、亲和色谱案例分析,1、凝胶过滤色谱（凝胶色谱分为凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱）文章名：凝胶过滤色谱法测定婴儿配方乳粉中-乳白蛋白作者：贾云虹，宋晓青，杨 凯作者单位：河北省三元食品有限公司发表期刊：食品科技发表时间：2015年食品科技（Food Science and Technology）1975年创刊，北京市粮食科学研究所主办，1996-2011年连续5届中文核心期刊。,背景-乳白蛋白中富含色氨酸，色氨酸是人体必需氨基酸之一。食用-乳白蛋白和食用酪蛋白的结果相比，大脑中的色氨酸含量比例高达48%，且减弱了中性氨基酸和色氨酸在穿过血脑屏障

9、时的竞争。这些依据表明，在婴儿配方乳粉中加入富含色氨酸的-乳白蛋白，使其接近母乳中-乳白蛋白的含量比例，是非常必要的。,-乳白蛋白检测方法,凝胶过滤色谱：根据蛋白质相对分子质量大小进行分离，紫外吸收检测。能检测出婴儿配方乳粉中非变性和在加工过程中变性的-乳白蛋白总量，操作简单，准确度高。流动相：6 mol/L盐酸胍溶液，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA，调pH=6.0，用0.45 m滤膜过滤。色谱条件：色谱柱TSK-2000SWXL凝胶色谱柱(7.8mm300 mm)；柱温30；流动相流速0.5mol/L；检测波长280 nm。（日本TOSOH公司生产的TSK-2000SWXL粒度5m，孔

10、径125，可以测量分子量5,000150,000。）,实验方法准确称取含有大约相当于10 mg蛋白质的样品，样品溶在盛有流动相溶液的10 mL容量瓶中，超声处理30 min。从以上样品中转移1.5 mL于10mL离心管中，加入10 L-硫基乙醇，摇动混合约10 s，让样品在室温下放置至少2 h，用0.45m微孔滤膜过滤至液相色谱进样瓶中，然后注射进液相色谱。根据标样峰面积和浓度建立标准曲线，从而计算样品中-乳白蛋白含量。选择色谱柱-乳白蛋白的相对分子质量为14200 u，而凝胶色谱柱TSK-2000SWXL分离样品的相对分子质量范围为5000150000 u，因此选择此色谱柱是比较合适的。组成

11、蛋白质的氨基酸在210280 nm范围内都有不同程度的吸收，但只有色氨酸在280 nm有足够高的吸收，而-乳白蛋白含有丰富的色氨酸，因此选择280 nm作为DAD的检测波长，能获得较好的灵敏度。,回归方程和检出限称取适量-乳白蛋白标准品，用流动相配制成0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的标准系列，按照1.3所述色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，做标准曲线，得到-乳白蛋白线性回归方程：Y=8407.6X-90.26，线性相关系数：R2=0.9998。以信噪比S/N=3计算-乳白蛋白的检测限为2.8 g/mL，完全能满足婴儿配方乳粉中-乳白蛋白含量的测定。婴儿配方乳粉中-乳

12、白蛋白含量的测定,2、亲和色谱文章名：亲和色谱应用于天然活性成分筛选的研究进展作者：冯颖淑1，童珊珊2，徐希明2等作者单位：1中国药科大学 2江苏大学发表期刊：中国中药杂志发表时间：2015年,亲和色谱法(affinity chromatography)是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。早在 1910 年，德国药理学家 Starken-stein 将蔗糖酶抗体吸附在高岭土上，研究了抗体和抗原的相互作用，为亲和色谱的萌芽。1924 年，俄罗斯学者 Engelhardt提出了“固定化配体原理”，作为分离生物活性物质的方法，为亲和色谱分离方法的根本。1970 年，Cuatrecases

13、 提出了“空间间隔臂”概念和方法，成功解决了配位体的立体可接受性问题。1972 年，德国学者Wulff 提出分子印迹色谱方法，进一步扩展了亲和色谱的应用，使得亲和色谱开始用于药物筛选研究。1978 年瑞典学者 Ohlson 提出以大孔微粒硅胶作为载体的高效液相亲和色谱方法，使得亲和色谱的发展跨入了一个新的时代。,亲和色谱法筛选技术受体为亲和配基的色谱筛选酶为亲和配基的色谱筛选血浆蛋白为亲和配基的色谱筛选以DNA为亲和配基的色谱筛选细胞膜色谱筛选脂筏色谱筛选分子印迹技术其他亲和配基（如核酸适配体亲和色谱、免疫亲和色谱、金属离子亲和色谱等等。）,文章名：壳聚糖螯合凝胶层析法纯化血液超氧化物歧化酶作

14、者：王保，全平娟，张永州等作者单位：河南大学，中科院生物物理研究所，兰州大学发表期刊：食品与生物技术学报发表时间：2014年,研究背景超氧化物歧化酶简称 SOD，是广泛存在于生物体内的一种可防止氧化损伤和缺失的活性酶，也是一种应用广泛的药用酶，具有抗衰老、预防辐射及治疗炎症等一系列功能，已经被广泛应用于食品及医药卫生行业。1975 年proath首次提出固定化金属螯合亲和层析（IMAC），利用固定在基质上的过渡态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基的配位作用，来实现对金属离子有亲和力的蛋白质的吸附和分离。在制备亲和介质时，常用的金属离子有 Cu2+，Zn2+和 Ni2+等，常用

15、的螯合配基有亚氨基二乙酸（IDA），三羧基甲基乙二胺（TED），次氨基三乙酸（NTA）等。固定化螯合亲和色谱常常以凝胶为载体，如在 SephadexG-75 或者DEAE-superpose 等凝胶上用化学交联方法引入螯合剂 IDA，再通过交联固定和亲和配（Ba2+，Cu2+，Zn2+）。用该方法制备的凝胶介质生产成本很高，软基质很易被压缩，不易被放大生产。近年来，随着基因工程下游技术的发展，基因重组蛋白质的分离纯化技术越来越显示其重要性，金属螯合层析技术（IMAC）分辨率高、选择性好，能在常规的变性条件下及非变性条件下进行蛋白质组分分离纯化。,作者以壳聚糖为原料，以固定相偶联的配基-亚氨基二

16、乙酸（IDA）及金属离子 Cu2+发生螯合作用，制得金属亲和层析凝胶，改凝胶化学稳定性好，基质稳定，容易再生，并首次以聚合高分子电解质聚丙烯酸钠对传统血液超氧化物歧化酶提纯工艺进行改进。实验方法 材料：新鲜猪血，柠檬酸三钠，氯化铜，丙酮，聚丙烯酸（PAA），不同相对分子质量聚丙烯酸钠（PAAS），固含 3.45%（质量分数）；壳聚糖，脱乙酰度90%，；SOD 活性试剂盒，低相对分子质量标准蛋白质，SOD 标准品，临苯三酚，SephedexG-75，DEAE-sepherose-fast flow4B。实验步骤,SOD的制备,壳聚糖制备凝胶,Cu2+螯合、平衡和SOD纯化,SOD 凝胶过滤层析纯化,SOD 离子交换层析纯化,SOD活力测定,蛋白质含量测定,SDS-PAGE 聚 丙烯 酰胺 凝胶 电泳,酶滋味光谱测定,结果分析壳聚糖螯合金属层析介质的作用机理（图1）不同相对分子质量聚丙烯酸钠对 SOD 酶活性的影响（图2）,纯化各步骤层析谱图（图3/4/5）,血液（取新鲜猪血 100 mL）SOD 各步纯化结果（表1）100 mL 的新鲜血球经金属螯合层析纯化后，虽然酶活性不及传统的离子交换和凝胶过滤层析等方法的，但是酶活性有很大的提高，产品得率和活性回收率分别达到 15.5%和 42.6%。,