内毒素检测进展.ppt

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1、1,第四军医大学西京医院检验科细菌室樊 新,内毒素检测进展及临床意义,2,内毒素（Endotoxin,ET）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，其化学成分为脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），由类脂A、核心寡聚糖O及多糖侧链组成。,3,一、内毒素的产生，作用机理及生物学效应内毒素的产生 以往认为ET作为细胞壁的结构成分只有在菌体死亡或人工裂解时才能释放出来。但近年来发现革兰氏阴性杆菌在细菌对数生长期或细菌营养缺乏时也可以以“出疱疹”的方式被释放ET。,4,ET的入血途径 肠道内毒素的吸收败血症时血中细菌的释放 外源性输入,5,内毒素的作用机理,6,TNF、IL-1IL-6、I

2、L-8,瀑布样反应，全身炎性反应综合症,急性炎症,PG、TXA、LTC、PAG、C5a、O2-、NO，弹力酶（二级介质）,脓毒综合征（发热、低温、心动过速、尿少、酸中毒、低血压）,DIC,内毒素休克,MOSF（多器官功能衰竭）,死亡,7,内毒素的生物学效应发热反应白细胞反应内毒素血症（ETM）与内毒素休克（ETS）弥漫性血管内凝血（DIC）,8,二、内毒素的检测,目前内毒素检测的方法主要有：鲎试验 ELISA法 结合免疫鲎试验法（IML）自动化动力学方法 化学发光法 光纤维生物传感法 毛细管电泳法,9,鲎试验 鲎试验（LT）检测LPS机理是LPS通过激活C、B因子、前凝固酶而使可凝蛋白变成凝固

3、蛋白，形成肉眼可见的胶冻状物，通过比浊，对LPS进行半定量或定量检测。该法简单、无需特殊设备、耗费少、敏感性较好，可检测出0.011ng/ml的LPS，但易受多种因素的影响。,10,标本颜色的深浅可使敏感性偏低；受血浆中LPS抑制因子的干扰；非特异性凝血酶、凝血活酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等均可使鲎变形细胞溶解物产生假阳性反应；LT法的标准化问题（目前国际尚无统一标准）。,11,ELISA法 利用多粘菌素B L聚组氨酸及广谱交叉反应性的抗LPSMcAb与LPS有广泛的结合能力的特点，用其包被微量反应板，加入待检样品，再加抗LPS单克隆抗体（McAb），通过酶标二抗的显示来定量测定LPS，该法敏感

4、性不高（0.5ng/ml），与LT法的相当,但定量准确性高于LT法。,12,结合免疫鲎试验法（Immunolimulus,IML）以广泛交叉反应性抗LPSMcAb（Wn1222-5）来捕获LPS，再与鲎试剂反应，可定量检测样本中肠杆菌科细菌感染所释放的LPS，敏感性可达100pg/ml。该法以抗LPS单克隆抗体为探针使内毒素血症检测特异性得以改善，且不受标本浊度、放置时间、抑制因子等非特异性因素的影响，但仍不能避免鲎试剂自身因素的影响。,13,自动化动力学方法 该方法先用KOH的复合碱试剂在微量反应板上对血浆标本进行预处理，以去除或灭活其中的干扰因子及酶抑制物，再直接加入对LPS高度特异的产色

5、鲎试剂（Endospecy），随后启动动态显色测定程序，检测仪自动绘制30min内的各孔反应曲线，根据标准曲线计算出样本中的LPS浓度。,14,该方法对LPS的定量范围为10100pg/ml。反应中所用产色鲎试剂不含G因子，因此可避免与标本中存在的真菌发生凝固作用而出现非特异性反应，其优点还体现在标本先用碱处理，从而克服了鲎试剂内的一些影响因素。,15,化学发光法 利用CR1和CR3受体诱导中性多核粒细胞中的氧化产物作为检测平台，依靠LPSLPS抗体复合物使全血中的中性粒细胞所释放的氧化物质，引起补体调理酵母多糖，导致发光物质（CL）氧化而发光，通过仪器光学系统检测发光的强度而定量测定血中的内

6、毒素，对LPS定量范围为20200pg/ml。该法对大多数革兰氏阴性杆菌的LPS有广泛的反应性，而对革兰氏阳性菌、曲霉菌等无反应，可望成为临床诊断内毒素血症的有用工具。,16,光纤维生物传感法 利用短波光纤维生物传感器检测LPS，最低敏感性为10ng/ml，可在30s内完成。其原理是共价结合于光纤维探针表面上的多粘菌素B可选择性地结合荧光标记的LPS，未标记的LPS在竞争试验中根据已标记的LPS产生的荧光强度得以定量检测。此法不仅应用于临床而且还可应用于环境中LPS的检测，该法虽快速简便，但敏感性不如IML法和ELISA法。,17,毛细管电泳法 LPS是缺乏有旋光力的基团，检测其未衍化的状态比

7、较困难。硼酸盐可与LPS分子的二乙基结合使其旋光力增强，采用UV活性多粘菌素B与LPS形成复合物或荧光素异硫基氟酸盐标记LPS亦可达到目的。方法是将处理过的标本吸入毛细管，用标准磷酸盐缓冲液（100mg/ml）做电泳，6min内即可完成检测。此法敏感性为35pg/ml，但电泳的条件不易掌握，且易受某些技术因素或固有误差的影响，目前尚难以推广应用。,18,MB80内毒素测定系统,内毒素葡聚糖,微生物快速动态检测仪,19,仪器概述 MB80内毒素定量测定系统是专门用于定量测定药品、生物制品、血液制品、医疗器械及食品中的内毒素含量，更重要的是在临床上用来测定病人各种体液中细菌内毒素的含量水平，以诊断

8、及鉴别诊断内毒素血症及感染的类型和程度，也作为观察内毒素血症疗效的重要指标。,20,检测原理 主要原理与鲎试验的反应原理相同：利用革兰氏阴性菌脂多糖激活酶反应主剂A中的相应因子后形成凝固蛋白，根据其引起的浊度变化对革兰氏阴性菌脂多糖浓度进行定量测定。,21,三、内毒素检测的临床意义,正常参考值：正常人血浆内毒素含量10pg/ml。革兰阴性菌败血症的诊断:通过测定人血浆中的内毒素即可对G菌所引起的临床菌血症及败血症进行确诊，而且对病原菌的分辨及各种感染症状治疗及预后判定都具有很大帮助。,22,呼吸道感染：由革兰阴性菌所引起的肺炎、胸膜炎及慢性支气管炎时，一般在血中的内毒素水平均较高。,23,肝脏

9、感染甲肝：甲肝的内毒素血症发生率为58，平均内毒素浓度为54.7pg/ml。在发病的前3周内毒素最低水平为37.7pg/ml。5周后开始恢复正常。乙肝：急性乙肝内毒素血症的发病率占51.9%，随着病情的缓解内毒素水平逐渐下降。慢性活动性乙肝时出现内毒素血症者占53.7%，并且有80的患者持续存在内毒素血症。丙肝：慢性活动性丙肝的内毒素血症发病率最高（80%），而且血清丙氨酸转氨酶水平与内毒素血症发生率及含量无明显关系。,24,肝硬化：肝脏可摄取血流中内毒素的8090%，由于肝硬变后造成的肝枯否氏细胞清除能力下降及肝内组织结构和血流的改变，肝内毒素摄取减少，造成严重的内毒素血症。胆道疾病：胆石症

10、伴胆囊炎的内毒素血症的发生率为78；化脓性胆管炎为20；梗阻性黄疸的程度与内毒素浓度以及持续时间有一定关系，术后的内毒素血症发病率为5075%，是术后出现并发症和患者死亡的一个重要原因。,25,急性胰腺炎：急性胰腺炎并发内毒素血症较常见，约占66，值得注意的是致死病例生前均并发内毒素血症且持续存在直至死亡。因此早期测定内毒素水平有助于判断疾病的严重程度，指导治疗，防止恶化。溃疡性结肠炎：此病的内毒素血症发病率高达100，也有个别报道的阳性率仅为25。但多数认为内毒素血症是该病的重要并发症。,26,细菌性感染的辅助诊断、治疗和预后判断全身性细菌感染：全身性细菌感染主要见于败血症。革兰氏阴性细菌性

11、败血症常并发内毒素血症。这种败血症较常见的致病菌为沙门氏菌属、脑膜炎双球菌属及拟杆菌属。这些致病菌多通过泌尿道、肠道、胆道及呼吸道而引起感染，也可通过外伤、外科手术、导管检查或留置，以及器械操作等途径而进入血液，并大量繁殖引起败血症，从而造成内毒素血症。,27,局部性细菌感染：局部性细菌感染造成内毒素血症的有肺炎、胆囊炎、烧伤合并感染、穿孔性腹膜炎、化脓性胆管炎、肝脓肿、肾盂炎、卵巢囊肿扭转伴尿路感染、肠结核及肺结核伴绿脓杆菌感染、非特异性出血性小肠炎及肾周围炎等。对尿液进行内毒素测定可成功地检出革兰氏阴性细菌菌尿症和厌氧性性阴性杆菌菌尿症(LPS50pg/ml)。,28,原因不明的发热免疫低下患者原因不明发烧时，如果找不到细菌感染迹象和菌血症侯，内毒素血症可能是引起发热因素之一。,29,外源性输注的内毒素血症的诊断 因治疗目的输入了污染有内毒素的液体、药物或血液等也可引起内毒素血症。,30,谢谢！,