内毒素凝胶法检查技术.ppt

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1、凝胶法BET检查技术,湛江安度斯生物有限公司2009年3月,2023/6/17,Page 2,1、凝胶法BET试验程序2、试验器具3、鲎试剂灵敏度复核4、干扰初筛试验5、干扰试验6、检查法7、实验相关知识及技巧,2023/6/17,Page 3,1、凝胶法BET的实验程序,试验准备确定供试品的内毒素限值选择鲎试剂计算最大有效稀释倍数或最低有效浓度鲎试剂灵敏度复核干扰初筛试验干扰试验日常检查,2023/6/17,Page 4,2、试验器具,试验器具的要求及处理玻璃器皿需经除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后在250至少干烤1小时塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验

2、无干扰的器械首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具,2023/6/17,Page 5,孵育反应仪器恒温水浴箱干式恒温仪,2023/6/17,Page 6,孵育反应温度是鲎试验的重要条件参数之一现行法规对反应温度的要求较宽松(371)严格的实验条件是实验室水平的重要标志之一80年代发达国家已使用干式恒温仪取代水浴箱2000年版中国药典BET法开始接受干式恒温仪,TAL-40型试管恒温仪的特点温控精确：370.2发热均匀：0.1可定时及提示：090分钟任意可设定时，到时蜂鸣提示试管免封口，无水蒸气或水滴影响体积小巧，使用方便,2023/6/17,Page 7,3、鲎试剂标示灵敏度的复核试

3、验,实验目的验证实验室的条件是否满足BET实验的要求验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等）是否满足BET实验的要求,2023/6/17,Page 8,实验步骤开启恒温仪器预热C溶液(标准内毒素溶液)的制备鲎试剂的准备加样及恒温反应结果判断数据处理,2023/6/17,Page 9,操作步骤示意图,翻转180度，观察凝胶状况,2023/6/17,Page 10,灵敏度复核试验举例,试剂,2023/6/17,Page 11,1）标准内毒素溶液C的制备,0.25EU/ml,30s,30s,1EU/ml,30s,30s,2.0ml,100

4、EU/ml,0.4ml,CSE,BET水,1.0ml,10EU/ml,0.4ml,3.6ml,0.5EU/ml,2.0ml,3.6ml,2.0ml,2.0ml,0.125EU/ml,30s,2.0ml,2.0ml,0.06EU/ml,30s,2.0ml,2.0ml,混合5分钟,2023/6/17,Page 12,2）鲎试剂的准备,取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两支，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列：用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解,阴性对照溶液D,0.06EU/ml,0.125EU/ml

5、,0.25EU/ml,0.5EU/ml,2023/6/17,Page 13,3）加样,用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液C，加入复溶的鲎试剂中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET水（D溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照,CSE,TAL,0.1ml,0.5EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.25EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.125EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.06EU/ml,0.1ml,0.1ml,BET水,0.1ml,加样顺序一般从低浓度到高浓度,2023/6/17,Pa

6、ge 14,4）恒温反应,将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入371的恒温器中孵育602分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染,2023/6/17,Page 15,5）结果判断,将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“-”。,阳性,阴性,结果判断：反应管缓缓倒转180 阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者试验符合要求的基

7、本条件：NC管全部阴性（）2管全部阳性（）0.25管全部阴性（）,2023/6/17,Page 16,6）数据处理举例,c=lg-1（X/4）=lg-1(0.903)(0.602)(0.602)(0.602)/4=0.210EU/ml 即本批号鲎试剂的复核灵敏度（c）为0.21EU/ml药典要求：当c在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度值。结论：本批TAL的灵敏度标示值符合规定。,2023/6/17,Page 17,4、干扰初筛试验,目的及原理本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选

8、出对鲎试验无干扰的浓度本试验可减少干扰试验的盲目性,2023/6/17,Page 18,试验步骤,供试品限值的确定供试品最大有效稀释倍数的确定试剂的选择反应溶液的制备加样及反应结果判断,2023/6/17,Page 19,干扰初筛试验举例,1）供试品限值硫酸庆大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U,2023/6/17,Page 20,2）最大有效稀释倍数的确定,最大有效稀释倍数MVD=cL/使用=0.5EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD0.5=因此可计算出使用不同时所对应的MVD：,0.5EU/ml,20000U/ml 0.5EU/10

9、00U,=20（倍）,2023/6/17,Page 21,3）试剂,为了方便试验，干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验,2023/6/17,Page 22,4）各反应溶液的制备,2023/6/17,Page 23,溶液C的制备,E100,0.4ml,3.6ml W,E10,溶液C：E2,溶液A的制备,S原液,0.4ml,3.6ml W,S10,溶液A,备用液,备用液,2023/6/17,Page 24,溶液B的制备,溶液B：SE2,注意事项：制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混 合至少30秒。,2023/6/17,Page 25,5）加样及反应,开启20支鲎试剂，分别用

10、移液器准确吸取0.1ml BET水将鲎试剂复溶取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反应管，每浓度平行2管另外取0.1ml BET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管。,2023/6/17,Page 26,6）结果判断,当溶液A、D均为阴性；溶液C均为阳性时，试验有效溶液B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为 S40,2023/6/17,Page 27,5、干扰试验,通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。至少对3批样品进行干扰试验。,2023/6/17,Page 28,

11、试验步骤,供试品限值的确定鲎试剂的选择最大有效稀释倍数的确定反应溶液的制备加样及反应结果判断,2023/6/17,Page 29,1）供试品限值,硫酸庆大霉素，20000U/ml；药典要求内毒素限值L=0.5EU/1000U,2）试剂的选择,根据干扰初筛试验的结果，供试品在40倍稀释（对应鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml）时无干扰一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验。这里我们选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行干扰验证试验。,2023/6/17,Page 30,3）最大有效稀释倍数的计算,MVD=cL/=80（倍）,4）各反应溶液的制备,2023/6/17,Page 31

12、,溶液C的制备,CSE(E4)、E2、E、E0.5、E0.25（即E0.5、E0.5、E0.125、E0.06、E0.03）,溶液C,混合5分钟,2023/6/17,Page 32,溶液A的制备,S原液,0.3ml,2.7ml W,S10,硫酸庆大霉素,S,0.3ml,S10,2.7 ml,1.0ml,3.0 ml,溶液A：S80,BET水,0.6ml,0.6 ml,S40,2023/6/17,Page 33,溶液B的制备,2023/6/17,Page 34,5）加样及反应,开启36支鲎试剂，先分别用0.1ml BET水复溶,再分别加相应的溶液0.1ml（A、B、C和D）37 1反应602分钟

13、,0.25EU/ml(2),0.125EU/ml(),0.06EU/ml(),0.03EU/ml(),BET水,S80 E0.25(SE2),S80 E0.125(SE),S80 E0.06(SE),S80 E0.03(SE),S80,2023/6/17,Page 35,6）结果判断,反应结果,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,2023/6/17,Page 36,结果计算及判断,药典规定：当溶液A和溶液D（阴性对照）的所有平行管都为阴性，且0.5 Es 2时，试验有效。当0.5 Es Et 2 Es时，供试品在该浓度下无干扰。本试验：1）0.5=0.06，2=

14、0.25 Es=0.125，0.5 Es 2，有效!2）0.5Es=0.06，2Es=0.25 Et=0.104，0.5 Es Et 2 Es，无干扰！结论：使用灵敏度=0.125EU/ml的鲎试剂对样品(S)的80倍稀释液(S80)作BET，无干扰。,ES=lg-1,4,(lg0.125)4,=0.125 EU/ml,Et=lg-1,=0.104 EU/ml,(lg0.06)+(lg0.125)3,4,2023/6/17,Page 37,6、检查法,1)凝胶法限量试验反应项目设置,试剂,2023/6/17,Page 38,根据干扰试验结果，供试品在80倍稀释，使用鲎试剂灵敏度为0.125EU

15、/ml条件下，对BET无干扰本试验选择TAL灵敏度为0.125EU/ml，供试品稀释80倍检查,各反应溶液制备,2023/6/17,Page 39,溶液C,溶液A,溶液B,加样及反应,开启8支鲎试剂，分别加0.1mlBET水复溶；再分别加入相应的溶液，每浓度平行2管,溶液D（W）,溶液C（E0.25）,溶液A（S80）,溶液B（S80 E0.25）,2023/6/17,Page 40,各0.1mL,各0.1mL,各0.1mL,各0.1mL,结果判断,当需要复检时，A溶液平行4管，若所有平行管均为阴性，则供试品合格；否则不合格。,2023/6/17,Page 41,+,2）凝胶法半定量试验,20

16、23/6/17,Page 42,注：A为不超过MVD并且通过干扰实验的供试品溶液，从通过干扰试验的稀释倍数 开始用检查用水稀释成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。B为2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D为阴性对照,反应项目设置,凝胶半定量试验举例,2023/6/17,Page 43,试剂,凝胶半定量法一般选用灵敏度较高的鲎试剂,各反应溶液的制备,溶液C的制备将CSE稀释成E0.125,E0.06,E0.03,E0.015浓度溶液溶液A的制备将供试品(S1)稀释至2倍、4倍、8倍,2023/6/17,Page 44,E1.25,0.4m

17、l,3.6ml W,加样及反应,2023/6/17,Page 45,溶液B的制备,近似稀释法,结果判断,2023/6/17,Page 46,试验有效条件*溶液D：*溶液B：*溶液C：E0.125且E0.015（即0.5c 2）,结果计算,2023/6/17,Page 47,所有平行管的反应终点浓度的几何平均值即为供试品的内毒素浓度(CE=Lg-1（X/2）:供试品内毒素浓度(CE)=当溶液A所有平行管均为阴性时，供试品溶液的内毒素浓度小于乘以初始稀释倍数(本试验初始稀释倍数为1)；当溶液A所有平行管均为阳性时，供试品溶液内毒素浓度大于或等于乘以最大稀释倍数（本试验最大稀释倍数为8）。,lg-1

18、,2,lg0.125+lg0.06,=0.08(EU/ml),7、实验相关知识及技巧,关于pH值的要求CP2005年版BET要求“一般要求供试品的pH值在6.08.0范围”USP的BET法要求是供试品与鲎试剂1：1的混合液的pH值在6.08.0；推荐的做法：在验证试验时，测定供试品溶液与鲎试剂的混合液的pH值，如果满足要求（pH值在6.08.0），则在日常检查试验中无需调节pH值。如果不满足要求，那么需进行pH的调节，且日常检查试验时，也必须进行同样的调节。,2023/6/17,Page 48,溶液B的制备方法,如需制备S4E0.25（供试品4倍稀释液，其中含有0.25EU/ml的内毒素浓度）1）50/50法 该法不能制备S1E22）近似法,2023/6/17,Page 49,3）一步法制备溶液C系列 如要制备E0.5，E0.25，E0.125及E0.06：,2023/6/17,Page 50,