免疫细胞的分离与检测.ppt

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1、一、免疫细胞的特征,1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子,NK cells,吞噬溶酶体,二、免疫细胞的分离技术,1、密度梯度离心法2、黏附分离法3、荧光激活分离法4、磁性分离法5、其他分离法,1、密度梯度离心法,聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分

2、层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。,离心前,离心后,稀释抗凝血,淋巴细胞分离液,血浆,单个核细胞,粒细胞,红细胞,2、黏附分离法-纯淋巴细胞群的分离,贴壁法：将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。,2、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离,尼龙毛法：混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则

3、通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。T细胞得率为20-30%左右。亲和板法：利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。,3、荧光激活分离法（FACS）,流式细胞仪,4、磁性分离法,（1）磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬

4、液中加直径为3m的羰基铁颗粒，置37温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。（2）磁激活细胞分离术MACs：是一种特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。MACS分选柱置于一个永久性磁场MACS分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。,MACS(阳性选择法）,N,S,MACS(阴性

5、选择法）,N,S,5、其他分离法,花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，达到可直接特异性检测t细胞的目的。作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。用于过继性肿瘤免疫治疗用于疫苗疗效的监测,抗原肽-MHC分子四聚体技术,MHC I类(左)和

6、类(右)分子四聚体结构示意图,三、细胞的冻存与复苏,1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130以下的低温中能减少冰晶的形成。2、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。,细胞冻存罐,第二节 免疫细胞膜分子的检测,一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法,一

7、、免疫细胞膜分子检测的原理与类型,1、以抗体识别抗原2、以配体识别受体,二、免疫细胞膜分子的主要检测方法,1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）3、花环形成试验,SmIg的荧光抗体检测法,SmIg的酶免疫检测法,补体依赖的细胞毒试验（CDC）,染料,补体,E-花环：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体,T细胞,B细胞,花环形成细胞,绵羊红细胞,EA-花环：B淋巴细胞表面有Fc受体，能与免疫球蛋白的Fc段结合，因此用抗体致敏的红细胞与B淋巴细胞混合，可见B淋巴细胞周围粘附有红细胞,EAC-花环：B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的红细胞中

8、加入补体，可形成红细胞-抗体-补体复合物，再与B淋巴细胞混合，则可形成EAC玫瑰花环。,第三节 免疫细胞功能测定,一、转化、增殖试验二、细胞毒试验三、抗体形成试验四、细胞吞噬与杀伤试验,1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆素A等）和特异性刺激因子（如抗原）；检测方法为形态学检测法和3H-TdR掺入法及MTT法等。2、混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、L

9、AK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。,一、转化、增殖试验,放射性测定,3H-TdR,丝裂原（抗原）刺激,淋巴细胞转化试验原理示意,小淋巴细胞在转化为原始母细胞过程中，合成DNA增加，能够吸收胸腺嘧啶核苷（3H）,1、T细胞介导的细胞毒试验2、ADCC作用测定3、NK活性测定,二、细胞毒检测试验,第三节 免疫细胞功能测定,放射性测定,细胞毒试验原理示意,靶细胞,效应细胞,分离上清,2、K细胞活性测定（ADCC活性测定）,动物机体有些免疫细胞，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）杀伤靶细胞，如NK细胞、活化的T细胞、吞噬细胞等，这类细胞统称为K细胞。K细胞的

10、活性不仅反映机体细胞免疫的能力，而且与体液免疫也有直接的关系。K细胞活性检测的方法有同位素释放试验法，溶血空斑法，细胞剥离法和靶细胞接合试验。仅介绍同位素释放法。,（1）原理,将靶细胞用51Cr标记后，再与特异性的IgG抗体结合，加入K细胞后即可发生ADCC效应，引起靶细胞的溶解并释放51Cr。用计数仪分别检测上清和细胞沉淀中的cpm，根据上清中释放的51Cr的多少，可判断K细胞活性的高低。,（2）方法,1、试验管：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细胞(Cr51标记的鸡红细胞)和亚凝集单位的抗体(兔抗鸡红细胞抗体)各0.1ml，加RPMI 1640完全培养基1.7ml（ADCC）。2、效应细

11、胞对照管：效应细胞和标记的靶细胞各0.1ml加上述完全培养基1.8ml（未加抗体）。3、抗体对照管：标记的靶细胞和亚凝集单位的抗体各0.1ml，加完全培养基1.8ml（未加效应细胞）。4、最大释放对照管：标记的靶细胞0.1ml 加蒸馏水 1.9ml（靶细胞会裂解，完全释放同位素）。5、自然释放管：标记的靶细胞0.1ml，加完全培养基1.9ml（靶细胞不裂解，但可自然释放一定量的同位素）。以上各管均置37520h后，2500g离心10min，分别取各管上清夜1.0ml置于5支试管中，用计数仪测各管上清和沉淀中的cpm值。,（3）结果判断和计算,51Cr实验释放率（%）2(上清cpm本底cpm)1

12、00%(上清cpm-本底cpm)(沉淀cpm-本底cpm)51Cr 特异释放率（%）试验释放率自然释放率 100%最大释放率自然释放率,3、NK细胞活性测定,NK细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞，其杀伤作用不需要抗体、补体的参加，所杀伤靶细胞通常指肿瘤细胞和病毒感染或转化的细胞。这样，可以将来源于同种动物的肿瘤细胞系或病毒转化的细胞系，作为检测NK细胞活性的指示细胞。NK细胞活性测定多采用51Cr释放法试验，其原理同细胞毒性T细胞试验中所采用的51Cr释放法试验。在这里以检测小鼠脾脏NK细胞活性为例，说明本试验方法。用3H-TdR掺入法，靶细胞为YAC-1细胞株（小鼠淋巴瘤细胞系）。,

13、（1）试剂 小鼠脾细胞悬液:分离单个脾脏细胞-裂解红细胞-淋巴细胞洗涤配置悬液（1640完全培养基2106/ml）。标记的靶细胞：活淋巴细胞（96%以上）加入H3-Tdr-孵育2小时/每30min振摇-洗3次-配成2106/ml悬液。,（2）方法 试验组孔：脾细胞悬液(淋巴细胞)：标记的靶细胞悬液100:1左右；对照组：单纯加标记的靶细胞。37 5%CO2培养18小时（NK细胞杀伤靶细胞）；每孔加终浓度为0.15%的胰酶和0.0125%DNA酶37处理30min（消化细胞和处理掉死亡靶细胞释放出来的放射性DNA）。各孔细胞收集后依次通过生理盐水，5%三氯乙酸和无水乙醇（获得了存活的靶细胞的标记

14、DNA）。待滤膜干燥后用液闪计数仪测定cpm值。三、结果计算 NK细胞活性以特异性杀伤率表示：特异性杀伤率（%）（1试验组cpm/对照组cpm）100%,1、直接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验,三、抗体形成试验,1、直接溶血空斑试验,2、间接溶血空斑试验,3、SPA-SRBC溶血空斑试验,1、细胞吞噬功能试验2、细胞杀菌功能试验,细胞吞噬与杀伤功能试验,吞噬百分率=,吞有颗粒的吞噬细胞数,计数的吞噬细胞数,吞噬指数=,吞噬细胞吞噬的总颗粒数,计数的吞噬细胞数,NBT还原试验,原理：,N-N-C+H+N=N-R-,N-NH2C N=NH,四氮唑基（淡黄色）,甲月

15、簪基（紫黑色）,NBT还原试验,方法：,1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、镜检。,正常值：,NBT阳性细胞 7.5-15%,第四节 免疫细胞凋亡测定,一、细胞凋亡的概念与原理二、细胞凋亡的检测方法,一、细胞凋亡的概念与原理,1、细胞凋亡的概念2、细胞凋亡的原理3、细胞凋亡的特点,1、细胞凋亡（apoptosis）,细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。,虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞 胀大，胞膜破裂，

16、细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。,2、细胞凋亡的原理,凋亡信号凋亡受体信号传导凋亡基因启动编码程序性死亡蛋白细胞结构解体细胞凋亡,细胞凋亡机制（动画）,3、细胞凋亡的特点,（1）细胞皱缩（2）染色质边集（3）凋亡小体出现,细胞凋亡,二、细胞凋亡的检测方法,1、形态观察法：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱

17、落后，形成许多凋亡小体。2、生化检测法：胞浆内Ca2+浓度升高。细胞内活性氧增多。质膜通透性增高。DNA内切酶被激活，双链DNA在核小体之间切断形成180200bp的特征性的有序片段。型谷氨酰胺转移酶和钙蛋白酶（Calpain）活性升高。3、流式细胞仪检测法,1、形态观察法,（1）普通光镜检测HE染色甲基绿-派诺宁染色：细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞

18、质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。,二、细胞凋亡的检测方法,甲基绿-派诺宁染色：光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细胞固缩：其中凋亡细胞细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞，核绿色着染，而细胞质无染色。,（2）荧光显微镜检测溴化丙锭（PI）染色：碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。,（3）透射电子显微镜：已经用于凋亡细胞的检测。镜下可见凋亡细胞体积变小、细胞质浓缩、细胞核变小、染色质浓缩并凝结成块，出现染色质沿核膜

19、内侧排列的核边集现象。晚期的凋亡细胞，清晰可见细胞核裂解产生的凋亡小体。,2、生化检测法,（1）凝胶电泳法：（2）原位末端标记法（3）二苯胺分光光度法,二、细胞凋亡的检测方法,（1）凝胶电泳法,原理：凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂。典型的细胞凋亡，在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段，而非典型的凋亡细胞，由于核内的DNA降解不完全，仅形成30050kb的DNA大片。利用这一特性，可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况。方法：提取总DNA DNA凝胶电泳 观察DNA ladder现象,凝胶电泳特点(1)本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。

20、(2)不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。,（2）原位末端标记法（TUNEL）,原理：利用标记的dUTP，在TdT作用下结合DNA断片的3末端羟基，显示断链DNA，提示凋亡方法：制备组织切片 标记物结合 标记物显色 镜检,TUNEL染色：细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。即凋亡的细胞,（3）二苯胺分光光度法,原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离，分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解细胞 13000g超速离心 分别提取DNA 使DNA显色，测定,凋亡百分率=,上清液OD值,上清液OD值+沉淀OD值,