信号转导研究方法.ppt

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1、信号转导通路研究策略和常用方法,功能分析,表达分析,如何分析信号蛋白？,何时何地表达 基因过表达，或基因沉默(细胞水平和整体水平)相互作用蛋白 立体论证,基因水平 转录水平 转录后加工 翻译水平 翻译后加工 mRNA和蛋白质降解,蛋白质基因表达可以在不同层次上调节,基因表达分析方法,启动子分析:-EMSA-Reporter gene assay-CHIP assay-Nuclear Run-on assay-DNA Foot-printing assay-DNA truncation and site-directed mutagenesis翻译水平分析:-Western Blots-Immu

2、nocytochemistry Immunohistochemistry-Protein modification-Proteomics,转录水平分析:-RT-PCR-Real Time PCR-In situ hybridization-Northern blots-RNase protection assay-Primer extention assay比较转录组学:-Differential screening-Subtractive hybridization-Differential display-Array-based methods,1.蛋白质表达水平和细胞内定位研究 信号蛋白

3、分子表达水平检测:Western blot analysis.ELISA Proteomics 信号蛋白分子在细胞内定位研究:Immunohistochemistry/Immunocytochemistry Immunofluorescence(IF)Green fluorescent protein(GFP)-fusion proteintypically,live cells.,印迹技术 blotting,将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加以检测分析的技术。应用：DNA、RNA、蛋白质的检测,DNA 印迹:Southern blottingRNA 印迹:Northern b

4、lotting蛋白质印迹:Western blotting,又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术。蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移（电转）至膜性支持物上(NC膜）,再与溶液中的抗体相互结合的技术。主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析、蛋白质化学修饰（磷酸化），以及蛋白质分子间的相互作用研究等。,Western blotting,Electrophoresis,转膜,Protein,HRP,DABH2O2,1Ab,2Ab,抽提细胞蛋白，定量聚丙烯酰胺凝胶电泳,与特异性抗体杂交。,根据标记物特点显色,硝酸纤维素膜,目的蛋白质,抗目的蛋白一抗,标记的二抗,偶联的碱性磷酸

5、酶,磷酸化生色体系,脱磷酸显色,采用Western blot方法检测蛋白质原理示意图,应用举例,某药物是否可引起目的蛋白的表达变化（上调或下调）？分别抽提细胞蛋白（未处理、药物处理），定量 相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳 印迹（电转移）杂交（抗体）显色/显影 根据显影结果判断：,内参,目标蛋白,检测标本很多的情况下Western 无法满足高通量的需求,ELISA/Phosphospecific-ELISAs(Enzyme Linked Immunosorbent Assay),检测蛋白质表达量或者活性状态(化学修饰-磷酸化)比western blot更快速、更高效.,蛋白质组（proteom

6、e）：一个基因组所表达的全部蛋白质.蛋白质组学（proteomics)：研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。,蛋白质组学(Proteomics),同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同；在空间和时间上呈动态变化,蛋白质组学研究技术平台(高效率,高通量)双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位和切取 质谱分析,第一向：等电聚焦电泳（IEF）,第二向：SDS-PAGE电泳,免疫荧光技术Immunofluorescence(IF),利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发

7、下可产生荧光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。,2.蛋白质与蛋白质相互作用研究技术:Co-IP（免疫共沉淀）with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein GST pull-down assay Yeas

8、t two-hybrid assay FRET(fluorescence resonance energy transfer)assay,agarose bead,IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G”能特异结合免疫球蛋白FC片段的现象而发展的方法。目前多用精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。,protein A,抗原,抗体,Y,裂解细胞 免疫沉淀蛋白质X,免疫共沉淀（Co-IP）技术,非变性条件下裂解时，完整

9、细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。若用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行Western Blot和质谱分析。常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质相互作用。,Western Blot和质谱分析,Co-IP工作示意图,Co-immunoprecipitation,binding,wash,elution,GST融合蛋白进行Pulldown实验,GST pull-down assay 原理 将GST融合蛋白(tagged protein(标记蛋白)or

10、 the bait(饵蛋白)，GST,His6,Flag,biotin)作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein,or prey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。,GST-Pulldown Assay,转录激活因子,DNA结合结构域(BD),转录激活结构域(AD),酵母双杂交技术,酵母双杂交技术是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。,在酵母细胞中分析蛋白质相互作用。以真核细胞转

11、录激活因子的结构为基础。,将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体(“诱饵”bait)，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体(“猎物”或靶蛋白prey or target protein);当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞含有上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。但限于核内表达的蛋白质的相互作用。,酵母双杂交系统,荧光共振能量转

12、移(FRET)是对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法，是在活体细胞中实时地对生物大分子之间的相互作用进行动态监测.两个携带不同荧光基团（如GFP、YFP、CFP等）的大分子在相互间距离足够近时会发生激发态能量非放射性地由一个荧光基团（供体）向另一个荧光基团（受体）转移的现象。如果发生FRET，则供体信号将淬灭而受体信号将激活或增强.FRET 检测系统可以快速高效地捕获来自标定分子间相互作用的短暂微弱的荧光信号，而以分子尺度分辨出供体-受体的平均距离，并能显示出受体-供体的相互作用。,蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy

13、 Transfer,以光线激发后，供体荧光基团(ECFPX)会将激发能量转移至距离10100 以内的受体荧光基团(EGFPY)，使之发出荧光。通过检测受体荧光基团激发的荧光即可确认两蛋白质间的相互作用。ECFP：强化型蓝荧光蛋白；EGFP：强化型绿荧光蛋白,FRET,3.磷酸化蛋白质研究方法:Western blot with phospho-specific antibodies.ELISA Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric analysis.,激酶活性的测定信号转导过程中往往涉及

14、多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。,4.基因转录活性检测 信号蛋白转录水平表达（mRNA）的检测:RT-PCR/Realtime RT-PCR Northern blot analysis.“gene chip”to measure changes in gene expression at larger scales.基因启动子/增强子转录活性的检测:Transient or stable reporter assayluciferase(Luc).,RT-PCR,RT：以polyT为引

15、物，在逆转录酶催化下cDNA合成PCR：特异引物进行目的DNA的扩增,应用：1.获得目的基因（编码蛋白）2.比较不同条件下mRNA变化,RT-PCR,Real-time PCR,用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析,荧光染料：,每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。,TaqMan 探针,寡核苷酸探针的5端标记一个荧光报告基团（reporter），3端标记一个荧光淬灭基团（quencher）。,报告荧光基团与淬灭基团分离，荧光共振能量转移不再发生，报告基团发绿色荧光,当激发光照射到探针时，被激发的报告基团将能量转移给附

16、近的淬灭基团而不发光。,每产生一条DNA链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。,5.蛋白质与DNA相互作用的研究技术:Gel shift(or electrophoretic mobility shift)assay(EMSA)typically,with smaller DNA sizes.Chromatin-immunoprecipitation(ChIP)assayto assess occupancy of DNA sites with specific factors in living cells.,Gel shift,染色

17、质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay,CHIP）体内分析蛋白质-DNA相互作用,真核生物基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。CHIP的基本原理:在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后免疫沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得体内蛋白质与DNA相互作用的信息。,6.基因或蛋白质功能研究 改变基因结构 基因突变（点突变、缺失、融合等）将突变基因或蛋白引入细胞以检测其功

18、能,Dominant negative mutants(缺失结构域突变体)Ligand-binding sitePhosphorylation siteDocking siteProtein-protein binding siteDNA binding site,基因表达或蛋白质活性的抑制，观察表型变化推测基因功能RNAiuse of small interfering RNA(siRNA)to reduce specific mRNA levels.Antisense oligonucleotidesRibozymeMonoclonal AntibodySmall inhibitor mo

19、lecules：tyrosine kinase inhibitor(TKi)在生物整体内改变基因表达或基因结构（转基因技术）transgenic Knock-out,RNA干扰技术 RNA Interference(RNAi),由双链RNA 所引起的序列特异性基因沉默,长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶切成个碱基对的短双链RNA，称为小干扰RNA小干扰RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导沉默复合体，该复合体可识别与小干扰RNA有同源序列的RNA，并在特异位点将该RNA切断。,RNAi实例(载体法)：,查找靶基因mRNA 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 根

20、据查找的siRNA序列，合成长链oligo 构建载体 转染 检测效应（包括干扰效应和生物学效应）,转基因：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，导入基因的表达可引起生物体性状可遗传的改变，称之为转基因。转基因动物：以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,转基因技术 transgenic technology,转基因动物模型实验步骤:转基因载体的构建；将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞；将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内；对转基因动物进行鉴定。,转基因载体,结构基因,报告基因,增强子,启动子,受精,全能性细胞,注射,植入,假孕小鼠,后代

21、,Southern blot,RT-PCR,Western blot,转基因小鼠,基因敲除技术 Gene Knock-out,体外合成无效基因或突变基因；定向插入(同源重组)宿主细胞染色体DNA中取代相应正常基因,使特定目的基因在细胞内或生物体内失活；应用转基因方法孵育出转基因动物,即为基因敲除动物。,基因敲除技术 Gene Knock-out,信号转导中第二信使含量的测定第二信使含量的高低同信号传递密切相关。1.Ca2+的测定：原子光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。目前常用标记示踪法，即用荧光探针标记靶细胞。常用的荧光探针有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-

22、1等，后二者较为敏感。2.IP3的测定：采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。此外，还可以使用Amersham公司生产的D-myo-IP33H分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此方法简易、敏感。3.DAG的测定：首先提取含DAG的样品，用DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入32-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量。4.cAMP的测定：（1）cAMP3H分析系统，其优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；（2）cAMP

23、125I分析系统，用于小量样品的分析；（3）cAMP ELISA测定方法，此方法简便、敏感。,例如检测组织或细胞中某个信号通路及其作用:1.样本（组织，细胞）；2.免疫组化，免疫细胞化学定位3.RT-PCR(Realtime PCR),Western blot 检测通路关键信号分子的表达（mRNA水平，蛋白水平），磷酸化状态；4.检测通路相互作用蛋白（CoIP等）6.关键信号分子基因沉默或增强（沉默：抑制剂/siRNA/抗体/基因敲除动物；增强：激动剂/构建过表达载体转染）7.芯片/组学检测,信号通路研究基本策略,例如研究某药物对细胞的作用及相关信号通路:1.药物刺激细胞（时间梯度，浓度梯度）

24、；2.检测药物对细胞的作用（毒性，增殖，凋亡，侵袭，迁移等）；3.共聚焦显微镜定位；4.RT-PCR(Realtime PCR),Western blot 检测通路关键信号分子的表达（mRNA水平，蛋白水平），磷酸化状态；5.检测通路相互作用蛋白（CoIP，FRET等）6.关键信号分子基因沉默（抑制剂/siRNA/抗体）后检测7.芯片/组学检测,谢谢,信号通路研究基本策略,基因功能研究策略,新发现的功能未知的基因：通过生物信息学分析对该基因所编码蛋白质的空间结构及功能进行预测;应用分子生物学技术在细胞及动物水平进行研究（蛋白表达，细胞定位，沉默或过表达对细胞功能的影响等）;通过探讨与该基因蛋白相互作用的蛋白而确定新基因的功能。蛋白质结构域分析和结构测定,