体外培养的准备与操作要点研究生课程.ppt
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1、第二章、动物细胞培养的要求、培养的准备与操作要点,江青艳,华南农业大学动物科学学院,一、细胞在体外生长的要求,环境要求:包括温度、pH值、气体、渗透压等;营养要求:天然培养基与合成培养基,温度:不同来源的细胞,其培养的最适温度不同。例如,昆虫及鱼类细胞25-28度,哺乳动物细胞一般为37-38度;细胞对低温的耐受力比高温强。温度不低于0 时,虽影响细胞代谢,但并无伤害作用;再把细胞置于2535 时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢。若温度过低,在降到冰点以下时,细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。若向培养液中加入甘油或二甲基亚砜等,封入冻存管,置于液氮中,细胞可耐受70 以下温度,能长期储存,解冻
2、后细胞复苏,仍能继续生长增殖,生物性状不受影响。,1、细胞培养的环境要求,细胞在3940 培养1h,能受到一定损伤,但仍有可能恢复,但不能忍受温度再升高2,持续数小时,即在4142 中培养1h,细胞损伤严重,温度至43 以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏,产生凝固酶使细胞发生凝固,另外是蛋白质变性。,pH值:动物细胞培养最适pH值为,低于6.8或高于7.6均对细胞产生严重影响,甚至导致细胞死亡;一般原代培养的细胞对pH值要求严格,细胞系对 一定范围的pH值改变有抵抗力。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受,偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞数量的增多、代谢
3、加强,释放CO2增多,使pH 降低。为了维持培养基恒定的pH,多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。实际工作中,一般在培养液中加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes):该物质对细胞无毒性,也不起缓冲作用,主要作用是防止pH迅速变动,在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。,气体:细胞在培养初期对溶氧要求较少,但在快速增殖(对数增长期或指数增长期)要求有较多的溶氧。采用开放式培养时(碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养),一般要把细胞置于95空气加5二氧化碳的混合气体环境中。渗透压:培养液的渗透压一般保持在与体液相同的水平,对细胞较为适宜。例如,生理盐水或平衡盐溶液。,2、细胞培养的营养要求,天然培
4、养基:来自动物的体液或组织液,早期广泛采用。例如:血清、组织浸出液等;优点:符合细胞生长的要求;缺点:成分不确定,来源复杂、有限,不能做到标准化。,合成培养基:根据动物的体液成份和细胞生长的需要,由各种营养物质组合而成,如MEM、DMEM、RPMI1640等。优点:能够标准化生产;缺点:不能完全满足细胞生长与增殖的需要。因此,在培养时,一般在培养液中加入一定量(10-15%)的血清,为细胞提供促贴壁因子或促生长因子。,血 清,血清的种类 胎牛血清:剖腹产的胎牛 新生牛血清:出生24h之内的新生牛 小牛血清:出生1030d的小牛(人血清、马血清、羊血清)血清的主要作用:提供基本营养物质,提供贴壁
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