体内药物分析方法及方法的设计与评价.ppt

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1、体内药物分析 Biopharmaceutical Analysis,体内药物分析方法及方法的设计与评价,生物样本经预处理后，选用适当方法进行测定。可供生物体液中药物及其代谢物含量测定的分析方法很多，归纳起来主要有三类：（一）光谱分析法（二）免疫分析法（三）色谱分析法,除以上三类主要方法外，在生物药物分析中有时还使用同位素标记药物，它们主要应用于RIA、同位素逆稀释分析，或作为GC-MS分析的内标，以及在药物分离中作示踪应用等。此外，还有一些含抗生素类药物的生物样品，它们可用微生物方法测定，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较样品与药物标准品两者对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，借以测定样品

2、内抗生素药物的浓度。,（一）光谱分析法,光谱分析法包括比色测定、紫外分光光度法和荧光分光光度法。光谱法在体内药物分析中是应用较早的方法之一，根据陆明廉对我国19751984年间血药浓度测定方法的统计，应用光谱法占应用血药分析方法总数的三分之一。虽然近十多年来色谱法的飞速发展，使光谱法退出了体内药物分析应用方法的主角地位，但因其操作简便、快速，在体内药物分析中仍占有一定的地位。,由于光谱法不具备分离功能，选择性较差，因此对样品的预处理要求较高。选用专属的方法或试剂与之反应，测定衍生物的荧光或对光吸收强度，也可借助数学的方法消除干扰。,1、比色法,比色法灵敏度不高，通常只能测定出1ug/ml浓度以

3、上的样品。但该法具有快速，简便，对仪器要求不高等特点。只要采用具有选择性的显色剂和反应条件，可不经分离提取等步骤，直接用于血药浓度监测。,2、紫外分光光度法,分光光度法的灵敏度较比色法高，适用于测定具有紫外吸收的药物，方法简单，仪器要求也不高。但用于测定含药浓度低的样品时，也受到一定的限制。如测定体液中药物浓度时，亦可能受体液中内源性杂质的干扰和影响。因此，本法在体内药物分析中也受到灵敏度和专一性的限制。但采用一些光谱分析技术，如用差示分光光度法，导数分光光度法，双波长和三波长分光光度法等，可适当提高方法的灵敏度和选择性，也可消除杂质的干扰，因此，该法目前仍用于一些生物样品中的药物检测。,3、

4、荧光分光光度法,荧光分光光度法的灵敏度比紫外-可见分光光度法的灵敏度高，最高可达到10-12g/mL，虽然有荧光的物质数量不多，但体内许多重要的生化物质、药物及其代谢物或致癌物都有荧光现象。由于荧光衍生物试剂的使用，进一步扩大了荧光分光光度法的应用，因此该法在体内药物分析和药物动力学研究中得到广泛的应用。,（二）免疫分析法,免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、荧光免疫分析等。该法的原理是利用抗原-抗体特异反应来测定体内药物的含量。该法具有灵敏度高、专一性强、操作简便、快速等优点，是临床治疗药浓监测和生化检验的常用方法，但需要一定的试剂盒和仪器。,(三)色谱分析法,色谱方法包括HPLC、GC和TLC

5、等方法。色谱法在我国体内药物分析中的应用始于20世纪80年代，由于色谱法具有分离分析功能，具有高的专属性和灵敏度，并能同时分离分析结构相似的药物和代谢物等优点，使得其近20年来发展迅速，尤其是HPLC法，己在体内药物分析领域中确立了主导地位，常用作体内药物分析中评价其他方法的参比方法。近年手性色谱技术、毛细管电泳技术、色谱与光谱联用技术、色谱与免疫联用技术等的建立与发展，更为色谱技术在体内药物分析中的应用增添了无量的前景。,1、HPLC法,HPLC法在体内药物分析中的应用已大大超过其他分析方法，成为体内药物分析中应用最广泛的技术之一。与GC法相比，它具有以下优点：(1)适用范围广，可在室温下进

6、行检测。对于挥发性低的，热稳定性差的，分子量大的以及离子型化合物等均可测定。,(2)样品预处理简单，可不经萃取和衍生化处理直接测定极性大的水溶性药物，特别适合生物样品的测定；(3)分离效率高，流动相选择范围广，仪器自动化程度高。(4)检测器多是针对整分子的光谱特征进行检测的，专一性较高。检测方法多采用非破坏性的。流出组分可回收，可用于样品的制备。,2、GC法,GC法是最先兴起的具有分离和分析两种功能的测定技术，在药物分析和体内药物分析中曾得到较广泛的应用。由于HPLC法的发展，尤其是RP-HPLC(反相-高效液相色谱法）的广泛应用，使GC法的应用相对减少。其原因是GC法本身具有一些缺点，应用时

7、常受被测组分的挥发性和热稳定性等方面的限制。用GC测定药物时一般需要在120以上柱温条件下进行，因此不适合用于遇热不稳定和极性大或挥发性差的药物，不适合用于生物样品的测定。因而影响该法在体内药物分析中的广泛应用。,（四）毛细管电泳法,毛细管电泳法(CE)，又称高效毛细管电泳法(HPCE)，是20世纪末发展起来的一种高效、快速的分析技术。HPCE是以高电压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品各组分之间淌度和分配系数的不同而实现分离的一类液相分离技术。近年来HPCE发展十分迅速，已在化学、生命科学和药学等领域得到广泛的应用。,由于该法具有高效、快速、灵敏、进样少、信息量大、运行成本低、易于自

8、动化等优点。因此使其在体内药物分析及其代谢的检测中得到广泛的应用。根据HPCE法的分离模式的不同。HPCE又分为：毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等速电泳和毛细管电色谱法。上述这些方法近几年来在体内药物分析中均得到不同程度应用。,选用何种方法进行体内药物分析为好呢？一般要根据药物的理化性质、结构持征、药物浓度大小、干扰成分的多少、预处理方法、实验目的以及实验室条件等因素综合起来进行考虑。,分析方法的设定依据,(一)做好文献总结、整理工作对已有报道的药物进行测定，应系统总结前人的文献，从中找出哪些问题已解决，还存在哪些问题等。对尚无文献报道的，也可根据药

9、物的性质情况，参考相似类型药物的文献资料。,(二)充分了解待测药物的特性与体内状况,药物的理化性质和体内过程是建立方法的主要依据。药物的理化性质包括酸碱性(pKa)、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、稳定性等，这些性质与分析方法的选择、实验条件的改善密切相关。与常规分析方法不同，体内药物分析的对象是来自生物体内的样品，因此对药物在体内的状况必须了解，如药动学参数、体内代谢情况等。这涉及样品取样频率与间隔，分析方法的选择等。,(三)明确测定的目的、要求,应了解拟建立的方法是用于测定药代动力学参数，还是用于临床药浓监测。前者要求具有一定的灵敏度和准确度，不强调简便、快速，设计方法时应考虑到不同时间获

10、得的样品中药物浓度变化较大这一因素。而用于临床药浓监测，则要求方法简便、快速。另外，是否要求同时测定母体药物和代谢物，若需同时测定两者，则应选择具有分离能力或专属的测定方法。,（四）结合实验室条件,根据实验室现有的和可能获得的设备条件加以考虑，选择可行的方法。,方法建立的一般实验步骤,方法初步拟定后，还需进行一系列实验工作，以选择最佳实验条件及验证所拟定的方法是否适合实样检测。通常包括下列步骤：（一）以纯品进行测定取药物或其代谢物纯品适量，按拟定方法测定，求得浓度与测定响应值之间的关系，进行线性范围、最适测定浓度、检测灵敏度、测定最适条件(如pH值、温度、反应时间等）等的选择。,(二)空白样品

11、测定,取空白生物样品，按拟定的方法进行处理，测定空白值(或色谱图)。空白值高低或色谱图状况将影响到方法的灵敏度和专属性，应力求将空白值降低。在色谱分析中应力求减少体内样品中内源性杂质峰，对无法消除的内源性杂质峰应设法使其从待测物的色谱区域内移开。能否取得良好的样品空白实验结果，是决定测定方法实际可行性的重要环节，必须设法解决。,(三)以水代替空白样品，添加标准后测定,以水代替空白生物样品，添加标准后按拟定的方法进行测定，以了解提取回收率及最低检测浓度的大致情况，从而对萃取溶剂、pH值、挥发浓缩等条件进行选择。,(四)空白样品中添加标准后测定,于空白生物样品中添加一定量标准品后按拟定方法进行测定

12、，求得样品回收率数据，建立标准曲线。若采用色谱法测定，多数情况下需要用内标法定量，则应首先选择合适的内标，然后进行回收率的测定。,(五)体内实际样品测定,经过上述(一)至(四)步骤后进行实际样品的测定。但要指出的是，以上步骤只是生物样品实样检测前的准备工作，不能完全确定是否适用于实样测定。因药物在体内变化是复杂的，如不注意药物代谢和蛋白结合情况，则应用体外建立的方法，进行体内实样测定时往往会失败，甚至导致错误的结论，所以在设计方法时强调对药物体内过程要有一定程度的了解，从而选择避免干扰和适合样品实际情况的方法。有时也可采用专属性强，已证明用于体内实样测定的步骤和方法作为对照测定，以此来检验所建

13、立的方法的实际可行性。,方法的评价,对于所建立的体内药物分析方法的可行性与可靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察与评价。这是研究和建立一个新的分析方法时必须着重抓住的几个环节。评价一个体内药物分析方法的优劣主要有以下几个指标：精密度、准确度、灵敏度、专属性或选择性、可测浓度范围、测定所需时间以及对生物样品的适应性等，现择要讨论如下：,（一）准确度,准确度(accuracy)是方法评价的最基本要点之一，它是表示测定结果与真值的符合程度。常用回收率(recovery)数值反映测定的准确程度，也可通过与其他已建立的方法进行比较的办法来加以反映。将已知量的药物纯品加到空白样品(如血样)中去，经过一

14、系列的处理、测定，所得药物量与加入量之比值的百分率即为回收率。,回收率当然越接近100越好，但因样品组分复杂，含量低，处理步骤多时就很难达到高的回收率。对于一个方法来说，更为重要的是每次测定所得回收率要保持恒定，虽然有时回收率较低，但只要重现性好，通过校正后仍可采用。根据回收率测定方法不同可分为绝对回收率和方法回收率。,1绝对回收率,绝对回收率也称萃取回收率、提取回收率，它反映了一个方法的萃取效率，与体内样品检测灵敏度有关，是评价体内药物分析方法的重要指标之一。现以色谱法为例，说明绝对回收率的求算过程。,例如取一定量被测药物标准品，加到空白血样中，按规定方法处理，使最后溶液中药物标准品浓度为1

15、ug/mL，测定色谱峰面积，记为A测，另取1ug/mL的药物标准品的纯溶剂溶液宜接进样，测得色谱峰面积记为A真，用外标法计算。,绝对回收率应考察高、中、低3个浓度，低浓度选择在定量限(LOQ)附近，高浓度在标准曲线的上限附近，中间选一个浓度。对于回收率的大小与变异不宜苛求，一般添加量在10-610-9级，绝对回收率若能达到5080，应认为是令人满意的。,在色谱分析中常采用内标法测定含量，将药物标准品和内标准物质加到空白血样中，按规定方法处理，测得药物和内标峰面积，求出它们的比值R测A药/A内。另取相同浓度的药物标准品和内标准物质的纯溶剂溶液进样，得药物标准品和内标峰面积，计算两者的比值R真A药

16、/A内。再根据下式求出回收率：,在内标法中，应注意药物与内标准物质各自用外标法测得的绝对回收率应相近，两者相差应小于10，否则回收率偏离100太远。,2方法回收率,取一系列浓度的药物标准品加到空白体液中，按设定方法测定，根据标准品浓度及响应的测定信号值绘制标准曲线，先按最小二乘法求出回归方程。然后取高、中、低浓度的药物标准品添加到空白体液中，每个浓度至少平行测定5份，按标准曲线制备方法同法测定，所得信号值代入回归方程，求得测定值。最后与加入量比较，得方法回收率。除定量限外，各浓度点测得的平均值偏离实际加入量应小于15，定量限这一点应小于20。,在测定回收率时，不管采用何种方法，都要注意以下几个

17、问题：添加的药物量必须与实际测定量相近；添加物质必须与实际存在的状态相似；必须同时做空白试验。,上述、两点的原因：一是如果添加量大，实际测定量小，那么有可能测定量在回收率的误差范围内，这样就不可靠；二是如果添加量大，蛋白质实际结合能力小，这样存在在空白血样中的添加药物部分没有结合，与实际存在的情况不符，测得回收率容易偏高。因此在报道一个方法的回收率时，必须说明添加量。,方法的准确度有时也可用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，然后比较两法测得结果的相关程度。用相关系数r来表示，一般要求r0.95，直线的斜率接近1，表明两法吻合。,(二)精密度,精密度(precisi

18、on)是表示一组测量值彼此符合的程度。有多种表示方法，在体内药物分析中常用的表示方法有：,精密度测定通常采用高、中、低三种浓度进行测定。低浓度选择在定量限(LOQ)附近，高浓度在标准曲线的上限附近，中间选一个浓度。每个浓度平行测定57次，计算测定结果的标准差。除定量限外，各浓度点的RSD不应大于15，最低定量限这一点不应大于20。精密度可进一步分为日内或批内精密度和日间或批间精密度。前者表示一次测定的重复性，后者表示不同时间测定结果的重复性。,日内(或批内)精密度是考察分析方法在短期内测定方法的变异情况，凡是在同一天内将样品多次测定所计算出的精密度称为日内精密度；凡在同一批内样品多次测定所计算

19、出的精密度称为批内精密度。所谓“批内”是指测定时使用同批试剂、同一条标准曲线等主要相同条件下完成的分析测定。,日间(或批间)精密度是考察分析方法在不同时间测定结果的变异情况。由于体内药物分析面临样品数量多，测定持续时间长，往往在同一天或同一批内不能完成，因此样品测定时使用的仪器性能、试剂、标准曲线及环境条件等都可能发生微小的变化，从而导致分析结果的变异增大。因此，考察分析方法的精密度时，还应考察日间或批间精密度。测定时可使用日内(或批内)精密度测定时，所使用的高、中、低三种浓度样品，在同一周内不同日(或不同批)分别测定35次，然后计算出RSD。,（三）灵敏度,灵敏度(sensitivity)是

20、指一种方法可以检测出有关化合物的最小量，常用以下几种表示方法。1检测限(limit of detection，LOD)检测限表示在生物介质中药物的最低可测度(或绝对量)。通常以被测信号和背景噪音比S/N为23倍时的被测物的绝对量来表示，LOD3N/S（N噪音，S被测物信号/单位重量)。,例如，在色谱分析中，测得N1mm，取2ug/mL的样品液20uL进样，测得峰高为30mm。按上式计算：,即以S/N3时，测得样品的LOD为4ng。也可通过多次空白试验，求得背景响应的标准差，再乘以2或3，作为LOD的估计值，然后配制相应检测限浓度样品，反复测试来确定。,2定量限(limit of qnantif

21、ication，LOQ),定量限是指生物介质中药物可定量测定的最低量，表示方式和测定方法与检测限相同，它与检测限的不同在于定量限规定的最低测得浓度应该符合一定精密度和准确度的要求。,通常以标准曲线的最低浓度点作为定量限。也可以S/N10或空白背景响应的标准差乘以10作为估计值，再通过试验确定。在进行药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验时要求LOQ至少能满足测定35个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/101/20时的药物浓度。,3最低检测浓度,最低检测浓度则多指可进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大小等因素有关，可通过下式求得，,以上表示灵敏度的方法均是指仪器的灵敏度，即进

22、入仪器的最低绝对量或最低浓度。如果我们要知道体内样品的浓度检测限，则要根据样品处理方法，考虑稀释度。体内样品的浓度检测限仪器的浓度检测限样品稀释度,例如，取血样1mL，经处理后进样前的血样最终体积为0.1mL，已知最低检测浓度为10-6，则血样中被测物的最低浓度为0.110-6。若经处理后，最终体积为10 mL，则血样中被测物的最低浓度为1010-6。这表明虽然仪器灵敏皮相同，但因样品预处理方法不同，就有可能影响到实际样品测定的灵敏度。,要提高检测灵敏度，可采用如下一些方法：提高仪器本身的灵敏度；提高进样量；降低仪器噪音；提高样品的浓缩程度或降低样品稀释度；消除干扰，降低空白值，这可通过改变色

23、谱条件，改进预处理方法来减少于扰杂质的影响。,（四）方法的专属性,方法的专属性(specificity)也称选择性(selectivity)，是指样品中含有其他共存物质时，该法定量测定被测物的能力。即测定的讯号应是属于被测物所特有的，否则就易受干扰。考察一个方法是否专属，应着重考虑代谢物、内源性物质和同时服用药物的干扰。,专属性的测定通常取6个个体空白样品(要求对这6个个体的取样时间、膳食结构以及影响实验的其他因素加以控制)，采用拟定的方法进行测定。所得结果与接近于定量限的被测物浓度的纯溶剂溶液所得结果进行比较。在药物、代谢物、内标物的tR处不应有大的干扰，任何有大的干扰的空白应舍去。如果大于

24、10的空白样品显示大的干扰，应另取一组空白样品重试，如果仍有10以上的空白样品显示大的干扰，则应改变拟定的方法，以消除干扰。,在报告专属性时，若采用色谱法测定，至少要提供空白生物样品色谱图，空白生物样品外加标准品色谱图及用药后的样品色谱图。,(五)线性范围,线性范围(1inear range)是指利用该法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且成线性的供试物浓度的变化范围。通常是将药物标准品加入空白体液中，制成一系列不同浓度的标准液，按规定方法处理、测定。根据药物标准品浓度和响应的信号值绘制标准曲线，或计算回归方程，求出r值和浓度范围。,标准曲线的制备一般由一个空白，一个零标准(空白样品加

25、内标)和58个非零标准(系列浓度标样)组成，要求覆盖实际的样品浓度范围，包括LOQ。空白和零标准不用作标准曲线的计算，仅作为对干扰的考察。线性程度可用最小二乘法处理数据，求得相关系数r，一般r不应低于0.99，同时必须符合一定的精密度和准确度。要求LOQ处偏离标准浓度应小等于20，其他各点应小等于15。,（六）稳定性,药物的稳定性(stability)是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数。在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。在生物样品中待测物的稳定性包括长期贮存、短期贮存和冷冻-解冻循环过程中的稳定性，也包括标准贮备液中待测物的稳定性。,1长期贮存稳定

26、性,长期稳定性的贮存时间应超过收集第一个样品至最后一个样品分析所需的时间周期。贮存温度一船为-20，如果需要也可在-70贮存。要求高、低浓度至少分别测定3次，与第一天测得的相应浓度的结果进行比较。,2短期室温稳定性,高、低浓度各3份于室温下放置424h(根据实际操作在室温中需维持的时间而定)，在不同时间点取样，进行分析，与0h测得结果进行比较。,3冷冻-解冻稳定性,取高、低浓度样品至少各3份，于-20贮存24h，取出置室温放置使自然融解。当融解完全后，取样，进行分析。然后再把样品放回冷冻状态保持1224h，如此解冻-冷冻应重复循环二次以上，然后比较各次分析结果。,4贮备液稳定性,药物与内标的贮

27、备溶液的稳定性应对其在室温下至少6h的稳定性进行考察，然后将其冷藏或冷冻714d或恰当周期后进行测定，所得仪器响应值与新鲜配制溶液所得响应值进行比较。,应用实例,例1：用HPLC法测定生物样品中淫羊藿苷的浓度。1、实验方法(1)色谱条件 色谱柱：Zorbax ODS(10um，4.6mm250 mm)；柱温：35；流动相：四氢呋喃-水-冰醋酸(20：75：5)；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：270nm；检测灵敏度：0.02UFS。,(2)生物样品的处理,血浆：取样品0.1mL置10 mL离心管中，加入乙酸乙酯3.5mL，振荡3min，离心(2000 r/min，5min)，移取上清

28、液，于50水浴用氮气吹干，残渣加内标液100uL，振荡溶解后进样20uL。,粪和尿：大鼠粪便样品于室温风干称重后，置乳钵内研成细末，用生理盐水按10稀释使其成混悬液。取混悬液0.5mL或尿样0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取两次，合并两次提取液，于50水浴用氮气吹干，加入甲醇1.0 mL，振荡溶解后进样10 uL。,组织匀浆：将大鼠断头处死，取心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、脑、睾丸各组织，称重，用组织匀浆器制成生理盐水匀浆，使每mL含各组织0.4g，取此匀浆0.2mL，按血浆样品处理方法进行处理分析。,2结果与讨论,(1)色谱行为 在上述色谱条件下，淫羊藿苷(icariin，ICA)与内标、淫

29、羊藿提取液中的其他6种成分及血浆内源性物质得到良好分离(见图4-1)，ICA及内标苯甲酸的保留时间分别为7.92min和11.93min。,(2)标准曲线的制备用甲醇精密配制成1mg/mL ICA标准贮备液，再用甲醇稀释成100ug/mL标准工作液，置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL内标贮备液，再用甲醇稀释成40ug/mL标准工作液，置冰箱保存。用ICA标准工作液及空白生物样品配制标准系列，按样品预处理方法操作，以ICA与IS峰高比为纵坐标，ICA浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。,由于粪和尿中的代谢产物干扰内标色谱峰，因此粪和尿采用外标法、以ICA峰高为纵坐标，ICA浓度为

30、横坐标绘制标准曲线。结果血浆、尿、组织匀浆和粪的线性范围分别为：1128，232，232，464ug/mL。血浆的标准曲线方程(n6)为：,其他生物样品标准曲线方程的r值均大于0.99。,(3)回收率 分别于空白血浆中准确加入一定量的ICA标准工作液，按上述方法经提取后进行HPLC分析，按血浆标准曲线方程测得浓度，求出方法回收率。标准品经提取后，与标准品直接进样测定所得各对应标准品与内标峰高比值相比较，求得血浆样品的提取回收率，见表4-1。其他生物样品的方法回收率均大于95.26，提取回收率均大于73.57。,(4)精密度 用空白血浆制成含ICA 2，8，32，128 ug/mL样品溶液各5管

31、，测定日内及日间误差，结果见表4-1。其他生物样品的日内、日间相对标准偏差(RSD)均小于7.1。(5)灵敏度测定 按色谱峰信噪比(S/N)为3作为检测下限，结果显示ICA的最低检测浓度为0.5ug/mL。,(6)色谱分析条件选择 淫羊藿提取液中的主要化学成分为淫羊藿苷，还有其他黄酮类化合物存在，因此在上述色谱条件下可出现67个蜂。为了获得最佳分离效果，首先用甲醇:水为流动相进行分离，当比例为55:45时，虽然ICA与其他化学成分已分离，但其保留时间较长，峰形较宽，且柱压较高。为此，选用对黄酮类化合物分离选择性较好的四氢呋喃，并加入一定量的冰醋酸，使弱酸化合物分离效果更佳。经过调整不同比例，多

32、次试验，最后确定四氢呋喃:水:冰醋酸最佳配比为20:75:5。,(7)内标选择 为能用内标法准确测定ICA浓度，本文对槲皮素、芦丁、橙皮苷、氨茶碱、阿斯匹林、非那西汀、黄体酮、苯甲酸和兰萼甲素等13种药物进行了测定，考察其与ICA在血浆中的分离情况，结果用保留时间小于ICA的药物作内标时，往往被血浆中干扰峰所干扰。阿斯匹林、非那西汀均在ICA前15min出峰，却被淫羊藿提取液中其他成分所干扰。兰萼甲素和苯甲酸均在ICA后24min出峰，没有任何峰干扰，因此两者均可作为内标，考虑到苯甲酸方便易得，故选用苯甲酸作为内标。,(8)提取溶媒的选择 本文考察了用乙醇、乙酸乙酯及乙醇:乙酸乙酯(1:5)为

33、溶媒对ICA进行提取测定，发现前者提取回收率小于60，而后者虽然提取回收率大于95，但带入杂质峰较多，而且色谱系统稳定性下降。因此实验选用乙酸乙酯为提取溶媒，各生物样品的提取回收率均大于73，且方法稳定。,(9)药物在生物样品中的稳定性 于各空白样品中加入ICA标准品，配制成15ug/mL浓度的样品数份，置-20冰箱保存，分别于第0、5、15、30 d按实验方法测定，RSD均小于7.1。说明该药物在各生物样品中-20冰箱保存下，至少可稳定1个月。,(10)血药浓度的测定 为了检验上述方法是否能满足ICA的药代动力学研究，应用本方法进行了大鼠静脉注射淫羊藿提取液。由大鼠颈静脉按10mg/kg静脉

34、注射，于给药后5，10，15，20，25，30，40，60，80，120，180 min于颈静脉各取血0.25mL，肝素抗凝，离心后取血浆0.1mL，按上述方法提取和测定ICA浓度，以给药时间为横坐标，血浆中ICA的对数浓度为纵坐标绘制药时曲线，见图4-2。,血药浓度测定结果表明，本文建立的分析方法可满足ICA药代动力学研究的需要，具有灵敏度高、准确性好等优点。,例2：用RP-HPLC法同时测定依普黄酮及其代谢物M-I血浆浓度。1实验方法(1)色谱条件 检测波长：254nm；色谱柱：Waters Nova-Pak C18柱(5um，3.9mm150 mm)；流动相：磷酸盐缓冲液(0.02mol

35、/L，pH值3.5)-乙腈(1:1)；流速：1.0mL/min；灵敏度：0.001AUFS；柱温：室温；进样量：1020 uL。,(2)溶液配制标准液及内标液：精密称取依普黄酮对照品10.00 mg于10mL量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至刻度，精密量取此液1.00 mL以流动相稀释至50.0mL，使其成20mg/L标准储备液，4 避光保存。精密称取依普黄酮代谢物M-I对照品10 mg，同法制成25mg/L标准储备液，4 避光保存。另以流动相为溶剂配制30mg/L的克霉唑溶液作为内标液，同法冷藏备用。,流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液，以磷酸调pH值至3.5，过滤，与等量乙腈混合，超声脱气

36、10min。,(3)标准曲线的绘制标准血浆：精密量取依普黄酮标准贮备液和代谢物M-I标准贮备液各100uL于10mL刻度试管中，加入空白血浆9.80mL，振荡混匀，再进行倍比稀释，使其成每mL含依普黄酮200.0，100.0，50.0，25.0，12.5，6.25，3.125ng，含代谢物M-I 250.0，125.0，62.5，31.25，15.625，7.813，3.906ug/L的标准血浆。,标准曲线：精密量取上述标准血浆1.00mL于10mL具塞玻璃试管中，加人提取缓冲液800 uL和内标液100uL，摇匀后加提取液叔丁基甲醚3mL，于液体混合器内混合液涡旋处提取1min，离心(300

37、0r/min)10min，吸取上层有机相置5mL尖底刻度试管中，在40水浴中通氮气吹干，以100uL流动相富集，进样1020 uL，测定峰高，依普黄酮与内标的峰高之比为横坐标，依普黄酮浓度为纵坐标绘制标准曲线；同法绘制代谢物M-I标准曲线。,2结果与讨论(1)线性范围和灵敏度 血浆中依普黄酮浓度在4200.0ug/L范围内，代谢物M-I浓度在4250.0ug/L范围内，线性关系良好，标准曲线方程分别为：,在本文条件下血浆中依普黄酮及代谢物M-I最低检测浓度分别为2.0ug/L和2.5ug/L，最低检测量分别为0.04ng和0.05ng。,(2)回收率与精密度实验提取回收率：取上述标准血浆，按标

38、准曲线项下方法处理，进样，测得峰高。另配制相应浓度的依普黄酮及其代谢物M-I溶液，在相同条件下直接进样，测定峰高，连续测定5次。平均提取回收率见表4-2。,方法回收率：取上述标准血浆，按标准曲线项下方法处理、测定，按标准曲线方程计算回收率，连续测定5次，结果见表4-3。,精密度：取上述标准血浆，按标准曲线项下方法处理、进样，连续测定5次，计算日内误差；另取上述不同浓度的标准血浆各5份，同法处理、进样，计算日间误差。,(3)选择性 选用检测波长254nm，在本文色谱条件下，依普黄酮及其代谢物M-I、内标物均有较大吸收。标准血浆中依普黄酮及其代谢物M-I和内标的保留时间分别为9.593.20和6.07min，无干扰蜂出现。样本血浆中虽有杂蜂出现，但与依普黄酮及其代谢物M-I及内标分离良好。色谱谱见图4-3。,