仪器教学：从基因组到蛋白质组.ppt

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1、仪器分析教学,从基因组到蛋白质组 复旦大学遗传所 王洪海 2009.4.10.,内容提要,一.人类基因组研究的意义二.人类基因组研究的现状三.蛋白质组研究的意义和前景四.蛋白质组研究的技术路线,一.人类基因组研究的意义,1986年美藉意大利科学家提出进行全基因分析，以寻找与正常人基因不同的肿瘤基因。1990年美国能源部和国立卫生研究院集中一批优秀的科学家准备投资30亿美元进行为期15年的人类基因组研究计划，对人类基因组作图和序列分析。希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息，即测定大约30亿碱基对DNA序列和识别其中所有的基因（约10万,5万，4万，3万）。,人类基因组研究的意义,人类基因组研究

2、计划，其意义和影响，远远超过曼哈顿计划（原子弹）和阿波罗计划（登月）。不仅美国、英国、法国、日本等发达国家参加了这项研究，就连亚洲、非洲和南美州一些发展中国家也纷纷加入这方面的研究。不仅政府部门投资进行这方面研究，而且一些大型药厂也对基因组计划极感兴趣，投入巨资。提前完成人基因组的测序，这样将为搞清肿瘤的发病机制，揭开人类衰老之谜，以及传染病的防治提供良好的对策。,二.人类基因组研究现状,我国在人类基因组研究方面取得了显著进展:1、湖南医科大学夏家辉等:家族性耳聋基因分析.Nature Genetics 1998.20(4):370-3932、上海第二医科大学陈竺等：白血病相关基因分析3、上海

3、肿瘤所顾健人等:肝癌相关基因分析4、中科院昆明生物所褚家佑等:中华民族基因关系分析 PNAS 1998;95:11763,研究现状,5、复旦大学遗传所人类基因研究方面:发现新基因 2500 确定功能的新基因 250条 申请专利 200项 疾病相关基因分析 Genomics 6、中科院遗传所人类基因研究中心:注册承担 30 Mb，占全部基因的1，2000.3.完成。7、国家科技部人类基因研究南方中心，北方中心:希望完成1000条基因,占全部的1.8、其它。,微生物基因组学研究,1、痢疾杆菌全基因组测序 北京病毒所金奇教授课题组2、表皮葡萄球菌全基因组测序 上海医科大学闻玉梅院士课题组,其他生物基

4、因组学研究,1、钩端螺旋体全基因组测序2、家蚕全基因组测序3、家猪全基因组测序,人类个体化全基因组学研究,1、西方白种人2、东方黄种人3、非洲黑种人,三.蛋白质组研究的意义和前景,（一）蛋白质组学的概念（二）基因组和蛋白质组的比较（三）意义和前景,（一）蛋白质组学的概念,1、蛋白质组:细胞内的全部蛋白质。2、蛋白质组学:从定性及定量的水平上研究细胞内所有 蛋白质及其动态变化规律的科学，是从 更为深入的层次上去认识生命活动的规律。,What is a Proteome?,The entire PROTEin population expressed by the genOME of a part

5、icular cell or tissue type.,Why are proteins important?,The genome sequence may be the blueprint of a cell,but proteins are the major building blocks.,（二）基因组分析和蛋白质组分析的比较,基因组 蛋白质组,组成 4种碱基 20种氨基酸；翻译后加工 组分 不变 动态变化：不同细胞；不同时空.分布 定位于染色体 分布于整个细胞 测序方法 简单，已完善 复杂：N末端已完善 C末端，发展中,（三）意义和前景,1、基因组基本上是固定不变的，即同一生物的不

6、同细胞中基因组基本上是一样的，人类的基因总数约是4万个。只从基因组DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等。这些在基因组中不能解决的问题，可望在蛋白质组研究中找到答案。因为蛋白质组是动态的，有它的时空性、可调及性；进而能够在细胞和生命有机体的整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律。,2、蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，将会在后基因组（post-genome)研究基因组功能研究上发挥重要作用。因此，蛋白质组研究可取得十分丰富的数据资料，能进一步带动生物信息学等现代边缘学科的发展；同时，也推动医药产业的发展。3、我国目前提出人类重要

7、疾病相关的蛋白质组学研究，集中在蛋白质组动态变化的功能蛋白质组研究上，越过总蛋白质组中“全部”这一难点，更具实践意义。在研究许多功能蛋白质组的基础上综合起来，就能描绘出接近于“全体蛋白质”的蛋白质组。,四.蛋白质组研究的技术路线,（一）不同结构层次的分离（二）蛋白质组学研究的基础（三）质谱分析相关的技术,（一）不同结构层次的分离,以阐明基因组功能为目的，蛋白质组研究必须获得这样的信息：细胞、组织或有机体内的蛋白质种类，翻译后修饰，分布，表达时间和表达量等。为此，蛋白质组分析首先要求分离亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次的蛋白质。,不同结构层次的分离技术,1、超速离心机分离方法 原理：根据

8、密度比重即分子量大小 2、双向凝胶电泳分离技术 原理：根据物资的等电点 和分子量大小3、各类层析分离技术 原理：根据物资的等电点 和分子量大小,1、超速离心机分离方法,贝克曼超速冷冻离心机,主要性能：最高转速80000RPM;最大离心力51500g；可调温度范围-30-40摄氏度；备有不同定角转头，分别适用于10ml，50ml，250ml体积样品的分离和提取。主要功能及应用范围：广泛应用于生命科学等研究领域的样品提取和分离；用于生物体细胞中的核酸，蛋白，酶等的提取和分离；也可用于对所研究的对象如生物细胞，细菌，血清，蛋白等有机物或无机物的乳浊液，悬浮液，胶体样品进行分离，提取，浓缩等制备工作。

9、,2、双向凝胶电泳分离技术,为了尽可能分辨细胞或组织内所有蛋白质，目前一般采用高分辨率的双向凝胶电泳。一种正常细胞的双向电泳图谱通过扫描仪扫描并数字化，运用二维分析软件可对数字化的图谱进行各种图象分析(image analysis)，包括分离蛋白在图谱上的定位、分离蛋白的计数、图谱间蛋白质差异表达的检测等。一张理想的双向电泳图谱可成为蛋白质组数据库的参考图（reference map)。,3、各类层析分离技术,蛋白质分析鉴定的基本要求（一检查指标 分析方法 鉴定标准 分子量 SDSPAGE 电泳银染色一条带符合设计要求指标 等电点 等电聚焦电泳 电泳银染色一条带，扫描95以上 浓度 紫外分光光

10、度法 浓度(mg/ml)1.45 OD280-0.74 OD260 纯度 HPLC（或FPLC）层析一个峰（95）Western Blot 有一条活性蛋白带,蛋白质分析鉴定的基本要求（二）检查指标 分析方法 鉴定指标 生物学活性 细胞学实验 符合国际规定的比活性和 动物实验 特定生物学检测指标 结构分析 氨基酸组成分析 各种氨基酸组分比例符合预计标准 氨基酸序列分析 N末端15个氨基酸符合要求 肽谱图 符合定点降解,（二）蛋白质组研究的基础：1.双向电泳技术 2.蛋白质的氨基酸组成分析 3.蛋白质的氨基酸序列分析 4.肽谱分析 5.微量测序,（二）蛋白质组研究的基础,1.双向电泳技术 2.蛋白

11、质的氨基酸组成分析 3.蛋白质的氨基酸序列分析 4.肽谱分析 5.微量测序,蛋白质组学研究的基本过程,样品,2-D PAGE,成像分析,蛋白质胶上酶解或膜转移等方法提取蛋白质或多肽混合物,质谱测定,肽质量及部分序列,Edman 降解,N-terminal 序列,Database searching,鉴定蛋白质,1、双向凝胶电泳（2D）,双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点在 pH 梯度胶中等电聚焦，然后按照它们的分子量大小进行SDSPAGE第二次电泳分离。蛋白质组研究通常需要对双向电泳分离的蛋白质进行鉴定。一种细胞或组织的蛋白质组双向电泳后可分离到几千甚至上万种蛋白质，一般对它们采取

12、分级鉴定，即先用快速、低廉的方法，再采用耗时、耗资的方法去鉴定蛋白质。,2、蛋白质的氨基酸组成分析,氨基酸组成分析由于耗资低而常用于蛋白质鉴定。组成分析对杂质污染较敏感。通过组分分析，可得到某一种蛋白质中所含各种氨基酸的比例。,3、蛋白质的氨基酸序列分析,Edman 降解法测定的蛋白质和多肽的氨基酸序列非常准确，但每次只能测定从N端起 115个氨基酸。一个大的蛋白质分子往往含有多于100个以上的氨基酸。因此需要进一步进行肽谱分析。,4、肽谱分析,对于大于 100个氨基酸的蛋白质需要化学方法（如CNBr）或生物学方法（酶解）将肽链断裂成不同短肽，测序后进行拼接而构成完整的序列。,5、微量测序,在

13、Edman 降解的基础上，目前已实现蛋白质微量测序的自动化。首先使凝胶分离的蛋白质直接转印到 PVDF 膜或玻璃纤维膜上，考马斯亮兰染色，甲醇冰乙酸脱色，直接将印迹有蛋白质的 PVDF 斑点块或条带，剪切下来，置于蛋白质测序仪中，可用于极微量水平蛋白质的鉴定。,蛋白质活性位点的分析,蛋白样品 SDSPAGE转移到NC，PVDF,Western Blot阳性条带,考马斯亮蓝R250染色对应条带甲醇脱色测序PSAPGLPVGT,抗原抗体免疫反应的高度特异性PVDF膜作载体测序的高度敏感性 对于蛋白质活性位点的分析和基因工程表达产物的快速鉴定，蛋白质组学中极微量蛋白分析提供一个特别有用的新手段。,相

14、结合,（三）与质谱分析相关的技术 质谱分析已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定大门。目前质谱广泛应用在蛋白质的纯度鉴定、分子量测定、序列测定、肽谱分析、二硫键、乙酰化、糖基化、磷酰化，以及非共价键结合等研究中。,质谱仪是利用电磁学原理，使气体分子产生带正电荷的离子，并按离子的质荷比将它们分离，同时记录和显示这些离子的相对强度的一种仪器。质谱法(Mass Spectroscopy,MS)一般采用高速电子束撞击气态分子，将分解出的阳离子加速导入质量分析器中，然后按质荷比(m/e)的大小顺序进行收集和记录下来，即得到质谱图。根据质谱图峰的位置，可以进行定性和结构分析；根据

15、峰的强度，可以进行定量分析。,一、异烟肼耐药菌株和敏感菌株的比较蛋白质组学,研 究 方 法结核分支杆菌培养7H9 Broth细菌壁蛋白的制备双向电泳考马斯亮蓝染色或银染MALDI-TOF-MS数据库检索,耐异烟肼菌株细胞壁蛋白质组双向电泳图谱,结核杆菌H37Rv株细胞壁蛋白质组双向电泳图谱,异烟肼耐药菌株和敏感菌株的差异蛋白分析,质谱分析鉴定的 6个差异蛋白,蛋白质名称 分子量/等电点 可比度（）1、海藻糖磷酸磷酸酶 45888/5.3 43%2、铁钼蛋白A 41721/8.7 25%3、莽草酸脱氫酶 28746/6.2 43%4、葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基转移酶 67503/5.4 30%5

16、、吲哚-3-甘油磷酸合成酶 28146/5.2 34%6、TetR 家族转录调节因子 24999/5.6 37%,1.莽草酸脱氫酶 Rv2552c,aroE 2.铁钼蛋白 Rv3109，moaA 3.海藻糖磷酸磷酸酶 Rv2006，otsB 4.葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基转移酶 Rv3436c,gimS 5.吲哚3甘油磷酸合成酶 Rv1611，trpC 6.TetR家族转录调节因子 Rv2506,6个差异表达蛋白及基因编号,蛋白质名称 分子量/等电点 可比度()基因信息1.海藻糖磷酸磷酸酶 45888/5.3 43%Rv2006，otsB2.铁钼蛋白A 41721/8.7 25%Rv3109，

17、moaA3.莽草酸脱氫酶 28746/6.2 43%Rv2552c,aroE4.葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基转移酶 67503/5.4 30%Rv3436c,gimS5.吲哚-3-甘油磷酸合成酶 28146/5.2 34%Rv1611，trpC6.TetR 家族转录调节因子 24999/5.6 37%Rv2506,样品制备（菌体蛋白）,双向电泳,数据库搜索蛋白质鉴定,PMF样品制备,MALDI-TOF-MS质谱检测,三、利福平耐药菌株和敏感菌株的比较蛋白质组学,凝胶图象分析,利福平耐药菌株菌体蛋白比较蛋白质组分析,pH:4 7,66.2KDa43.0KDa31.0KDa20.1KDa14.4KDa,M.tb H37Rv株菌体蛋白2-DE图谱,2-DE分析,M.tb 临床敏感菌株 利福平单耐药菌株,利福平单耐药菌株差异蛋白的鉴定结果,耐多药菌株菌体蛋白比较蛋白质组学分析,2-DE分析,M.tb H37Rv株菌体蛋白2-DE图谱,pH:4 7,66.2KDa43.0KDa31.0KDa20.1KDa14.4KDa,M.tb 临床全敏感菌株 耐多药菌株,耐多药菌株差异蛋白的鉴定结果,谢 谢,