仪器分析第四章高效液相色谱分析法.ppt

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1、第四章 高效液相色谱分析法,第一节 高效液相色谱仪,美国安捷伦公司 Agilent 1200,第一节 高效液相色谱仪,美国戴安公司 UltiMate3000,第一节 高效液相色谱仪,一、高效液相色谱仪结构流程,二、高压输液系统,三、梯度淋洗装置,六、液相色谱检测器,五、分离系统,四、进样系统,第一节 高效液相色谱仪,储液瓶,高压泵,进样器,色谱柱,检测器,废液,一、高效液相色谱仪结构流程,高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器,第一节 高效液相色谱仪,二、高压输液系统（高压泵）,要求：输出压力高；平稳、脉冲小；流量稳定可调；耐腐蚀。,机械往复柱塞泵结构图,第一节 高效液相色谱仪,三、梯度淋洗装

2、置,在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、极性来改善分离和调节出峰时间。,第一节 高效液相色谱仪,两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入混合器，混合后进入色谱柱。,一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。,高压梯度(外梯度),低压梯度(内梯度),第一节 高效液相色谱仪,通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。,梯度洗脱,梯度洗脱的特点,改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移。,第一节 高效液相色谱仪,四、进样系统,六通阀进样 装置,第一节 高效液相色谱仪,内径：16

3、 mm，柱长：550 cm；柱填料粒径：5 10m,为保护色谱柱，通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。,五、分离系统（色谱柱）,第一节 高效液相色谱仪,六、液相色谱检测器,类型,紫外检测器,示差折光检测器,荧光检测器,电化学检测器,电导检测器,第一节 高效液相色谱仪,（一）、紫外检测器应用最广泛的检测器,基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合郎伯-比耳定律。,优点：灵敏度高，线形范围宽；死体积小；波长可选；对流速和温度变化不 敏感；可用于梯度洗脱。,缺点：无紫外-可见吸收组分不响应；流动相选择受一定限制。,第一节 高效液相色谱仪,一些

4、常用溶剂的紫外截止波长,第一节 高效液相色谱仪,(a)可变波长紫外检测器,(b)二极管阵列检测器,第一节 高效液相色谱仪,两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器,峰纯度检验,第一节 高效液相色谱仪,（二）、示差折光检测器通用型检测器,基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度成正比。,每种物质具有不同的折光指数。,生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。,第一节 高效液相色谱仪,缺点：灵敏度低；对温度敏感；不能用于梯度洗脱。,第一节 高效液相色谱仪,（三）、荧光检测器专用型检测器,基本原理：

5、在一定的条件下，荧光强度与流动相中的组分的浓度成之比。,对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,第一节 高效液相色谱仪,特点：高灵敏度；高选择性；可用于梯度洗脱。,第二节 主要分离类型,一、液-固吸附色谱,二、液-液分配与化学键合相色谱,三、离子交换色谱,四、离子对色谱,五、空间排阻色谱,六、亲和色谱,第二节 主要分离类型,一、液-固吸附色谱,流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。,固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。,颗粒度较小，5-10m,分离机理：流动相中的溶质分子(X)与溶剂分子(S)在固体吸附剂上竞争吸附的结果。,第二节 主要分离类型

6、,下标M、s分别代表流动相和固定相，n代表被吸附的溶剂分子数；K代表吸附平衡常数。,吸附平衡常数K不等于分配系数。K值越大，保留时间越长，分配系数大。,适用对象：相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。,第二节 主要分离类型,二、液-液分配与化学键合相色谱,（一）、液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）。,基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。,与气相色谱中气-液色谱比较？,改变流动相的组成来 改善分离效果。,K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关。,第二节 主要分离类型,正相分配色谱（正相柱）,组分极性越大，保留时间越长；使用极性化合物的

7、分离。,反相分配色谱（反相柱）,组分极性越小，保留时间越长；适用非极性化合物的分离。,第二节 主要分离类型,（二）、化学键合固定相色谱,固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。,特点,将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。,第二节 主要分离类型,1.键合固定相制备,ODS(C18)键合相,硅胶,十八烷基氯硅烷,非极性,硅烷化反应,使用pH范围：2-8,第二节 主要分离类型,2.键合固定相类型,类型,反相柱,正相柱,氨丙基氰乙基、醚和醇等极性基团,不同碳原子数的烷烃（C8和C18）、苯基等疏水基团,第二节

8、主要分离类型,保留时间：,例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。,没食子酸,3,4-二羟基苯甲酸,固定相:非极性;流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸没食子酸,第二节 主要分离类型,三、离子交换色谱,固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。,阳离子：SO3H(强)CO2H(弱)阴离子：N+R3(强)NH2(弱),担体,苯乙烯-二乙烯苯共聚物微球,键合基团,键合,第二节 主要分离类型,流动相：阳离子交换树脂固定相，采用酸性水溶液；阴离子交换树脂固定相，采用碱性水溶液。,基本原理：试样组分在固定相上发生的反复离子交换反应，依据组分与离子交换剂之间亲和力的

9、不同而分离。,第二节 主要分离类型,阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3 M+H+阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4 X+OH-,一般形式：RA+B=RB+A,试样组分与交换基团间的作用力的大小决定色谱的保留行为。,第二节 主要分离类型,阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3 M+H+阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4 X+OH-,组分与离子交换剂之间作用力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。作用大，保留时间长。,应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸、蛋白质等。,第二节 主要分离类型,四、离子对色谱,离子对色谱:用正向或反向色谱柱分离离子和中性化合物混合物的方法。,离子对

10、：两个相反电荷的离子相互作用形成一个中 性化合物。,第二节 主要分离类型,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相（固定相）中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配。,第二节 主要分离类型,由于待测离子的性质不同，与对离子形成离子对的能力不同，形成的离子对的疏水能力不同，在两相间的分配系数不同，从而实现色谱分离。,阴离子分离：烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子。阳离子分离：烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子。,第二节 主要分离类型,五、空间排阻色谱-凝胶色谱,原理：利用凝胶中孔径大小的不同，按分子大小分离。

11、小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。,快速分离不同分子量混合物的色谱方法。,第二节 主要分离类型,相对分子质量差别大于10的化合物才可以分离,排阻色谱分离示意图,第二节 主要分离类型,六、亲和色谱,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特性亲和力，进行选择性分离的一种色谱方法。,具有反应活性的连接链（环氧、联胺等）,酶、抗原等,第三节 液相色谱的固定相与流动相,一、固定相,二、流动相,第三节 液相色谱的固定相与流动相,一、固定相,固定相,分配色谱固定相,液-固吸附色谱固定相,离子交换

12、色谱固定相,空间排阻色谱固定相,手性固定相,第三节 液相色谱的固定相与流动相,（一）、分配色谱固定相,分类,全多孔型固定相,表面多孔型固定相,化学键合固定相,多孔球体(氧化铝、硅藻土等)+固定液,微珠担体(玻璃微球)+固定液,硅胶表面键合有机分子,早期固定相已不多见,第三节 液相色谱的固定相与流动相,利用硅胶表面存在的硅羟基，通过化学反应将有机分子键合到硅胶表面。,化学键合固定相,A.硅氧碳键型：SiOCB.硅氧硅碳键型：SiOSi C C.硅碳键型：SiCD.硅氮键型：SiN,第三节 液相色谱的固定相与流动相,ODS(C18)键合相,硅胶,十八烷基氯硅烷,双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定

13、分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主。,第三节 液相色谱的固定相与流动相,（二）、手性固定相,将手性冠醚或环糊精键合到二氧化硅上。用来拆分生物、药物分子和天然有机化合物。,环糊精结构图,第三节 液相色谱的固定相与流动相,二、流动相,液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成、极性改变，可显著改变组分分离状况，改变流动相的组成和极性（组成比例）是提高分离度的有效手段。,常用溶剂：环己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水等。,第三节 液相色谱的固定相与流动相,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。,水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋

14、喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),常用溶剂的极性顺序,第三节 液相色谱的固定相与流动相,1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,选择流动相时应注意的问题,2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,第三节 液相色谱的固定相与流动相,3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,第四节 影响分离的因素与分离类型选择,一、影响分离的因素,二、分离类型的选择,第四节 影响分离的因素与分离类型选择,一、影响分离的因素,速率方程,溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一,第四节 影响分离的因素与分离类型选择,修正的速率方程：,A.降低颗粒度大小，填充均匀；B.减小液膜厚度；C.选择粘度小的溶剂；D.选择较低的流动相流速。,提高柱效途径,第四节 影响分离的因素与分离类型选择,二、分离类型的选择,根据分析目的、试样性质、化合物的结构,气相色谱与高效液相色谱的比较,