仪器分析第七章分子发光分析法.ppt

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1、第七章 分子发光分析法,基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)，电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时，以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量。,分子发光：,分子发光,+,电能,化学能,光能,生物活性参与化学发光,电致发光,化学发光,光致发光,生物发光,荧光,磷光,第七章 分子发光分析法,分子发光：,光致发光：,第七章 分子发光分析法,第一节 分子荧光、磷光产生基本原理 第二节 荧光光谱与基本特征第三节 荧光产率与分子结构的关系第四节 影响荧光强度的环境因素第五节 分子发光光谱仪结构流程第六节 定量分析方法,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,一、分子基态、激发态,二、电子自旋多

2、重度,三、激发态到基态的能量传递途径,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,一、分子基态、激发态,激发态：基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到高能级的分子轨道上称为电子激发态。是分子的亚稳定状态。,基态：在正常状态下，分子处于最低能级的分子轨道上称为基态。是分子的稳定状态。,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,二、电子自旋多重度,电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子可以处在不同的自旋状态,常用电子自旋多重度来描述。,M=2S+1,S是电子的总自旋量子数,S为各电子自旋量子数的代数和。,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,单重态（M=1）：电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用“S”表示。,三重态（M

3、=3）：分子中的电子对的电子自旋平行的电子态称为三重态，用“T”表示。,S2 T2 S1 T1 S0,(洪特规则),第一节 分子荧光磷光产生基本原理,三、激发态到基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和非辐射跃迁(热)等方式失去能量。,返回速度快的途径，发生几率大!,e,1.振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。,(一)、非辐射跃迁,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,e,2.内转换：相同多重度的电子能级中,相等能级间的非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12 s。,第一节 分子

4、荧光磷光产生基本原理,e,3.系间跨越：不同多重态在有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自旋-轨道耦合等跃迁。,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,4.外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,1.荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态各振动能级，发射时间约为10-710-9 s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。,e,(二)、辐射跃迁,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,2.磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态各振动能级。发光时间：1

5、0-4100s。,e,S0 激发态振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫 T1 S0,第一节 分子荧光磷光产生基本原理,第二节 荧光光谱与基本特征,一、荧光激发光谱,二、荧光发射光谱,三、荧光光谱的基本特征,第二节 荧光光谱与基本特征,一、荧光激发光谱,固定荧光波长，改变激发光波长，测定不同波长的激发光激发所得到的荧光强度与激发光波长曲线。,激发光谱相当于荧光物质的吸收光谱。,第二节 荧光光谱与基本特征,二、荧光发射光谱,固定激发波长，扫描发射波长，测定化合物发射的荧光强度与不同发射波长曲线。,发射光谱的形状与激发波长无关。,第二节 荧光光谱与基本特征,三、荧光光谱的基本特征,（一）、Stokes位移

6、 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。产生原因：1.振动弛豫及内转换，产生位移主要原因；2.基态不同振动能级间振动弛豫至最低振动 能级；3.外转换。,第二节 荧光光谱与基本特征,（二）、发射光谱的形状与激发波长无关 荧光分子吸收不同波长的能量，电子跃迁到不同激发态能级，产生不同吸收带，但都通过无辐射跃迁方式回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态各振动能级，产生波长一定的荧光。,第二节 荧光光谱与基本特征,（三）、荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,第三节 荧光产率与分子结构的关系,一、分子产生荧光必须具备的条件,二、化合

7、物的结构与荧光,第三节 荧光产率与分子结构的关系,一、分子产生荧光必须具备的条件,1.具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构的有机分子；2.具有一定的荧光量子产率。,荧光量子产率（）：衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光(或磷光)的比例。,第三节 荧光产率与分子结构的关系,f,=,发射的光量子数,吸收的光量子数,f,=,发射荧光的分子数,被激发的分子数,第三节 荧光产率与分子结构的关系,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：,荧光发射过程的速率常数，取决于分子结构。,各种无辐射跃迁过程的速率常数之和。取决于分子所处的化学环境

8、，同时也与化学结构有关。,第三节 荧光产率与分子结构的关系,二、化合物的结构与荧光,（一）、跃迁的类型,对于有机荧光物质:,n*max100 平均寿命10-510-7 s；*max104 平均寿命10-710-9 s S T速率kISC小。,*是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。,*,*n,第三节 荧光产率与分子结构的关系,（二）、共轭效应,产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向移动。,第三节 荧光产率与分子结构的关系,（三）、刚性平面结构,芴,f=1,联苯,f=0.2,1.减少分子振动，减小外转换。2.增大分子吸光截面，增大摩尔吸光系数。,第三节

9、荧光产率与分子结构的关系,荧光黄,f=0.92,酚酞,f=0,第三节 荧光产率与分子结构的关系,（三）、取代基效应,1.给电子取代基加强荧光,-HN2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN,产生 p 共轭,2.吸电子取代基减弱荧光,-C=O，-COOH，-NO2,n*跃迁，摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱，相应磷光增强。,第四节 影响荧光强度的环境因素,一、溶剂,二、温度,三、溶液的PH值,四、内滤光作用与自吸现象,五、荧光猝灭,第四节 影响荧光强度的环境因素,一、溶剂,主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键的形成对化合物的荧光发生变化。*跃迁类型：激发态极性比基态大

10、，溶剂极性增大，跃迁能量降低，发生红移，荧光增强。溶剂与荧光分子形成氢键、配位键主要影响荧光分子的存在型体、电离状态，荧光强度和形状均发生很大变化。,第四节 影响荧光强度的环境因素,二、温度,温度升高，外转换的几率增加。荧光强度降低。,三、溶液的PH值,不同PH值下，荧光分子存在形式不同。,第四节 影响荧光强度的环境因素,四、内滤光作用与自吸现象,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含有能吸收荧光物质发射的荧光的组分，如色胺酸中的重铬酸钾。,第四节 影响荧光强度的环境因素,五、荧光猝灭,荧光分子与溶剂分子或者其他分子之

11、间存在相互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。,（一）、碰撞猝灭-动态猝灭,M*+Q M+Q+热量,激发态分子,猝灭剂,第四节 影响荧光强度的环境因素,（二）、生成化合物的猝灭-静态猝灭,M+Q M Q,基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。,（三）、氧的猝灭,氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，可能包含着多种机理。,第四节 影响荧光强度的环境因素,（四）、自猝灭,荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低。,此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等。,自猝灭可能有如下几个原因：1.荧光物质分子之间的碰撞能量损失;2.荧光物质的自吸收;3.荧光物质分子的缔合。,第五节

12、分子发光光谱仪结构流程,Cary Eclipse 荧光分光光度计荧光、磷光化学/生物发光美国瓦里安技术中国有限公司,第五节 分子发光光谱仪结构流程,一、荧光分光光度计结构流程,二、磷光分光光度计结构流程,第五节 分子发光光谱仪结构流程,一、荧光分光光度计结构流程,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理仪器控制,发射单色器,第五节 分子发光光谱仪结构流程,组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器。特殊点：两个单色器，光源与检测器通常成直角。,第五节 分子发光光谱仪结构流程,（一）、激发光源,氙灯、高压汞灯，染料激光器。,（二）、单色器,激发单色器：选择激发光波长，用以分离出所需用的

13、激发光。发射单色器：选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。,第五节 分子发光光谱仪结构流程,（三）、样品池,I0,It,If,样品池四面透光。,（四）、检测器,光电倍增管。检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。,第五节 分子发光光谱仪结构流程,二、磷光分光光度计结构流程,利用荧光和磷光发射寿命的差别,通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。,第六节 定量分析方法,二、定量方法,一、定量依据,第六节 定量分析方法,一、定量依据,荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光量子产率：,由朗伯-比耳定律得：,荧光强度 If：,第六节 定量分析方法,对于稀溶液，当 bC 0.05（磷光 bC 0.01）时：,If-荧光强度I0-入射光强度f-荧光量子产率b-吸收光程-摩尔吸光系数C-物质浓度,Ip-磷光强度I0-入射光强度p-磷光量子产率b-吸收光程-摩尔吸光系数C 物质浓度,第六节 定量分析方法,二、定量方法,标准曲线法：,直接荧光标准曲线法,荧光熄灭工作曲线法,比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。,