介绍几种新的感染性标志物1218太工讲.ppt

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1、2023/6/14,1,讲者介绍,胡锡池，硕士，毕业于苏州大学病原生物学专业。无锡二院“青年人才库”培养对象，长期从事微生物的鉴定与耐药性的监测工作。现为无锡市第二人民医院临床微生物室专业主管，同时也是无锡耐药监测平台主要成员。近三年在省级核心期刊上发表细菌耐药方面的专业论文近十篇，获省级新技术引进奖两项，在研市级立项课题一项。,2023/6/14,2,介绍几种新的感染标志物,无锡二院胡锡池,2023/6/14,3,当前抗感染领域现状,随着各类侵入性诊断操作的应用，多重耐药细菌的蔓延，严重烧创伤、器官移植病人和放化疗病人的增加，医院性感染、脓毒血症和多器官功能衰竭综合征（MODS）的发生率不断

2、升高。尽管现代医疗已取得很大进步，但上述感染并发症仍是危重病人晚期死亡的主要原因。因此对这些感染并发症进行早期治疗显得尤为重要。然而感染并发症的传统诊断指标存在耗时、敏感性和特异性不高的缺陷。因此，寻找新的，敏感而特异的感染性标志物在当下就显得尤为重要。,2023/6/14,4,几种新的感染标志物,1、降钙素原（ProcalcitominPCT）2、内毒素3、(13)-D-葡聚糖（G试验）4、半乳甘露聚糖（GM试验）5、呼吸道病毒7项检测（直接免疫荧光法）,2023/6/14,5,降钙素原（ProcalcitominPCT）,2023/6/14,6,降钙素原概述,降钙素原是正常人血清中存在，含

3、116个氨基酸组成的糖蛋白，最初由甲状腺C细胞产生;在非感染或病毒性感染疾病时保持非常低的血清水平，在细菌性感染时含量升高，并与感染程度和预后呈正相关;目前国外认为PCT为一种新的具有创新意义、可用于诊断和监控严重细菌感染及脓毒血症、败血症等疾病的理想指标，具有高度的敏感性和特异性;PCT含量的变化稳定，并出现在疾病的早期（3-4h）。半衰期(24h);正常血清水平:100-150pg/ml。,2023/6/14,7,哪些情况下降钙素原会升高,全身性细菌感染；严重休克、SIRS和MODS。真菌、寄生虫、立克次体、结核感染；病毒感染、肿瘤、过敏、自身免疫性疾病及局部感染患者中，PCT水平可轻度升

4、高；,2023/6/14,8,PCT的临床意义,早期诊断 在感染发生2-3h血浆PCT浓度就会升高.病情监测在脓毒性休克时PCT含量最高，可达1000ng/ml，是正常人的2000倍。随着感染的恢复PCT也随着下降。PCT升高幅度依次为Sirs（全身性炎症反应综合症）+/，Sepsis（败血症）2+、Severe Sepsis（严重败血症）3+、Sepsis Shock（败血症休克）4+预后判断 动物实验证明，PCT是一个潜在的致死因子，本身不会启动脓毒性反应，但可放大并加重脓毒性的病理反应，当PCT含量升高时死亡率也升高。鉴别诊断 细菌感染和非细菌性炎症反应（自身免疫性疾病等）的鉴别诊断 细

5、菌感染和病毒感染的鉴别诊断（脑脊膜炎等）器官移植术后鉴别诊断（细菌感染、病毒感染、吸收热、排斥反应、真菌感 染等）脓毒性休克和非脓毒性休克的鉴别诊断,2023/6/14,9,PCT 的实验室检测,免疫发光法(ILMA)法国梅里埃公司、美国罗氏 该方法敏感性高,特异性强，此法测定的低限值为0.1ng/ml,检测耗时约2h。SPCT-Q-半定量快速实验-德国评细替、武汉海特 该方法操作简单、结果易观察的特点。其低限值为0.5ng/ml。检测耗时约0.5h。（无锡雷赛公司）放射免疫学分析法 透射免疫浊度法,2023/6/14,10,不同人群中血浆PCT的值,2023/6/14,11,PCT 与其它感

6、染性指标的比较。,PCT PS WBC:特异性高：全身性感染既可导致白细胞升高,也可以引起白细胞减少。PCT PS CRP：灵敏度好：PCT可在感染后2个小时后检测；CRP在炎症过程开始812h 后，才能从血清中检测出。PCT PS IL-1、IL-6、TNF-:稳定性好：PCT 的半衰期较长(2024h)；IL半衰期很短(数分钟至几小时)。E66851108,2023/6/14,12,内毒素检测,2023/6/14,13,内毒素研究背景,1.,据统计，我国每年各种感染病人达到2亿人次，发热病人达到3亿人次，其中G-菌感染占很大比例。,由革兰氏阴性菌所引起的内毒素血症及脓毒血症是目前临床上的主

7、要死亡原因之一。,早期的数小时内作为临床上抢救感染性休克的关键，因此，早期体液中内毒素的正确、快速定量检测及相应的对症治疗就显得格外重要。,内毒素的快速定量测定有助于对G-菌感染的早期诊断、治疗方法的选择及疗效的判断。,2.,3.,4.,2023/6/14,14,定义,细菌内毒素（Endotoxin）是G-菌细胞壁上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖（LPS）中的类脂A。,2023/6/14,15,内毒素的生物学效应,2023/6/14,16,内毒素血症与临床疾病的相关性,2023/6/1

8、4,17,体液内毒素水平增高是严重细菌性感染（尤其是革兰染色阴性菌）的一个重要的特异性指标，而且，也是脓毒血症和全身炎症反应综合症的可靠指标。内毒素水平不仅可用于感染类别的鉴别诊断，也可用于感染控制和病情转归的参数。因此，建议在适当的时候可对内毒素的水平作一系列连续动态的监测。,内毒素检测的临床意义,2023/6/14,18,(13)-D-葡聚糖(G试验)半乳甘露聚糖(GM试验),2023/6/14,19,当前侵袭性真菌感染(IFI)检测的现状,发病率呈逐年上升趋势，且漏诊率居高不下。据尸检研究发现，75%的IFI病例在生前漏诊，主要原因是IFI的临床表现不典型易被基础疾病所掩盖，导致诊断困难

9、。目前常规微生物学检查（直接涂片镜检和真菌培养）耗时长，干扰因素多。而分子生物学检查（真菌DNA的检测）门槛过高，且不能提示现症感染。病理检查常因患者的病情所限难以实施。因此寻找有效的感染性标志物对于快速诊断侵袭性真菌感染、制定正确的治疗方案、争取最佳治疗时间，意义重大。,2023/6/14,20,真菌感染的诊断,深部真菌感染的临床表现 深部真菌感染影像学特征 微生物学检查 主要包括两方面:直接涂片镜检和真菌培养.分子生物学检测-真菌DNA的检测 真菌细胞壁组分检测(1,3)-D-葡聚糖(G试验)真菌抗原检测 半乳甘露聚糖(GM试验)，分布于大多数曲霉属真菌胞壁中,2023/6/14,21,1

10、-3-葡聚糖的检测(G试验),真菌在自然界中分布很广,其细胞壁主要成分为(1-3)-D-Glucan(葡聚糖).当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理，1-3-D葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液（如尿、脑脊液，腹水，胸水等）中1-3-D葡聚糖含量增高。浅部真菌感染中，1-3-D葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。,2023/6/14,22,快速检测血液等体液中酵母菌、丝状真菌等细胞壁成分，不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属。另据文献报道，检测葡聚糖含量不能用于隐球菌感染的诊断，可能因为隐球菌在免疫缺陷患者体内生长缓慢，并形成

11、厚荚膜。有体外实验表明，新生隐球菌产生的1-3-D葡聚糖量比念珠菌和曲霉菌少。是早期真菌感染的敏感生物标志可鉴别致病菌和定植菌,1-3-葡聚糖的临床意义,2023/6/14,23,1-3-葡聚糖（G试验）-北京金山川,酵母菌、丝状真菌细胞壁成分；不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属；不能检测：隐球菌和接合菌；美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册；敏感性、特异性：90左右,2023/6/14,24,半乳甘露聚糖(GM试验),半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）是曲霉菌细胞壁的组成成分，当曲霉在组织生长时可释放进入血循环。检测的是半乳甘露聚糖，主要适于侵袭性曲霉

12、菌感染的早期诊断。当菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。GM释放量与菌量成正比，可以反映感染程度。连续检测GM可作为治疗疗效的监测。,2023/6/14,25,GM检测的临床意义,GM检测有助于IPA的早期诊断，而且还有助于抗曲霉治疗的疗效以及疾病转归的判断血清中GM的量伴随IPA的进展会增加，也会随着药物的有效治疗而下降。如果在IPA的治疗期间，其GM抗原血症持续保持较高水平者，其预后则较差，此时试着更改治疗方案。相反，GM抗原血症清除早且明显者，其预后则较理想，应正确判定病情后及时撤药。跟踪研究发现，肾功能严重受损也会影响GM抗原血症的清除。,2023/6/14

13、,26,半乳甘露聚糖（GM试验）-美国伯乐,曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原 可以从血清、脑脊业、胸水、BALF检测到 方法：ELISA（BioRad）：敏感性高1ng/ml Latex agglutination：15ng/ml,2023/6/14,27,G试验与GM试验比较,2023/6/14,28,G试验在以下情况可出现假阳性,使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；使用多糖类抗癌药物。服用多粘菌素B,厄他培能,头孢噻肟,吡肟,优力欣,磺胺等药物链球菌血症；操作者处理标本时存在污染、标本溶血；放化疗造成的粘膜损伤导致食

14、物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等,2023/6/14,29,G试验在以下情况可出现假阴性,之前使用过抗真菌药物、标本放置时间过长，导致分解代谢。试验操作过程中离心时间过长。,2023/6/14,30,GM试验在以下情况可出现假阳性,饮用牛奶或高蛋白食物；血液透析；自身免疫性肝炎等；食用污染的大米等。,2023/6/14,31,GM试验在以下情况可出现假阴性,释放入血循环中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除；以前使用了抗真菌药物；粒细胞缺乏的患者。,2023/6/14,32,G试验、GM试验结果与临床诊断不符合时的原因分析,患者是不是粒缺的状态患者饮食或药物的干扰操

15、作是否规范(分析前,分析中,分析后等)试剂和仪器是否状态良好,2023/6/14,33,仪器检测原理：G试验、内毒素,北京金山川-MB-80检测仪（动态比浊法）动态定量检测革兰阴性菌可溶性抗原（脂多糖），真菌可溶性抗原（1-3）-D葡聚糖，通过连续检测浊度变化建立时间（T）与微生物含量（C）关系的标准曲线，再经过光电转换原理，由软件系统分析得出样品中含真菌可溶性抗原或内毒素含量。,2023/6/14,34,PCT，G试验，GM试验，内毒素检测,早期诊断快速诊断指导用药评价效果动态观察,2023/6/14,35,呼吸道病毒7项检测（直接免疫荧光）,2023/6/14,36,呼吸道病毒感染 概述,

16、呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据统计，90%以上的急性上呼吸道感染由该类病毒引起。,Karin M et al.Cell.2006 Feb 24;124(4):823-35.,2023/6/14,37,呼吸道病毒感染 病毒分类,呼吸道病毒包括：正粘病毒科：流感病毒副粘病毒科：副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒其他病毒科：腺病毒、风疹病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼肠病毒,2023/6/14,38,呼吸道病毒感染 病毒分类,2023/6/14,39,呼吸道病毒感染 流行病学,流感病毒感染发生高峰期在北半球一般

17、是从11月到4月腺病毒出现在深冬到夏初RSV通常是在冬天到早春，持续5个月流行副流感病毒爆发会持续一年。,2023/6/14,40,呼吸道病毒检测 临床意义,Byington,C.L.,H.Castillo,et al.(2002).“The effect of rapid respiratory viral diagnostic testing on antibiotic use in a childrens hospital.”Arch Pediatr Adolesc Med 156(12):1230-4.,为临床合理用药指导依据，防止抗生素的滥用。减少耐药菌的产生，节省病人开支。,202

18、3/6/14,41,呼吸道病毒检测 方法,分离培养需要专业技能，时间长，成本高。PCR成本高，实验室条件要求高EIA低敏感性，假阴性高，IgM&IgG IF快速，稳定，敏感，特异性强,2023/6/14,42,检测解决方案 D3 Ultra TM,1983年成立，Ohio University，230名员工。年销售额超过4亿美元。呼吸疾病，疱疹&衣原体感染，甲状腺疾病等Athens,Ohio&Cleveland,Ohio全球最大细胞株和病毒株供应商江苏省代理：无锡赛拓基因生物科技有限公司,2023/6/14,43,检测解决方案 检测原理,FITC标记的某病毒特异性单克隆抗体与细胞中相应的病毒抗

19、原结合后，形成抗原抗体复合物，荧光显微镜下细胞内显示苹果绿荧光。而未发生抗原抗体特异性反应的细胞，被Evans蓝复染成红色。,2023/6/14,44,检测解决方案 产品特点,直接免疫荧光快速检测和鉴定种常见的呼吸道病毒（RSV，ADV，FLUA/B,PIV1/2/3）；高敏感性、特异性和稳定性；可作为其他快速检测的确认试验，减少假阴性结果；2010年注册上市,2023/6/14,45,检测解决方案 临床验证,苏州大学附属儿童医院 温州医学院附属第二医院上海市儿童医院超过1000例样本,2023/6/14,46,检测解决方案 检测流程,阳性结果判断：显示苹果绿荧光的细胞，为阳性细胞。当放大倍数为200倍时，在视野中找到2个阳性细胞，判为标本阳性。,振荡，离心，去除上清，制成细胞悬液,把细胞涂抹在板上，风干，丙酮固定，D3抗体反应，封闭，盖玻片,液体样本,观察细胞内部，病毒特异性染色在FITC显微镜下观察成苹果绿,2023/6/14,47,总结,1、降钙素原（细菌感染)2、内毒素(革兰氏阴性杆菌)3、(13)-D-葡聚糖（真菌感染）4、半乳甘露聚糖（真菌感染）5、呼吸道病毒7项检测（病毒感染）,2023/6/14,48,谢谢大家!,