硫瑾石墨烯纳米复合物标记信标抗体磁控【推荐论文】 .doc
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1、精品论文硫瑾-石墨烯纳米复合物标记信标抗体磁控电化学甲胎蛋白免疫传感研究林幼秀,周倩,唐点平5(福州大学化学化工学院,食品安全分析与检测教育部/福建省重点实验室,福州 350108) 摘要:本文以单克隆甲胎蛋白抗体修饰磁珠作为免疫传感探针,硫瑾-石墨烯功能化的信标 抗体作为追踪,建立一种新型的磁控电化学甲胎蛋白免疫传感新方法。在甲胎蛋白和外加磁 场的作用下,免疫传感器探针与信标抗体之间形成的夹心免疫复合物就被附着在磁性电极的 表面。随着样品中甲胎蛋白浓度的增加,在电极表面固定的硫瑾-石墨烯纳米复合物的量也10增加,从而导致电化学信号的改变。在优化的实验条件下,该免疫传感探针的电化学信号与 甲胎
2、蛋白浓度的对数呈现线性关系,线性范围为 0.1 - 100 ng/mL,检测限为 0.06 ng/mL。同 时,该免疫传感探针具有重现性好、选择性高等特点,将其用于病人的血清样品分析,其结果与电致化学发光免疫分析方法相比,相对标准偏差(RSD)小于 6.0%。关键词:分析化学;磁控电化学免疫传感;磁珠;硫瑾-石墨烯纳米复合物;甲胎蛋白15中图分类号:O657Magneto-controlled electrochemical immunoassay of alpha-fetoprotein using thionine-graphene nanosheets as labels20Lin Yo
3、uxiu, Zhou Qian, Tang Dianping(Key Laboratory of Analysis and Detection for Food Safety (Ministry of Education and Fujian Province), Department of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, FuZhou 350108)Abstract: In this paper, a newly magneto-controlled electrochemical immunosensing st
4、rategy was25designed for sensitivie detection of alpha-fetoprotein (AFP), as a model, using anti-AFP primary antibody-functionalized magnetic beads as immunosensing probes and thionine-grephene-labeled secondary antibodies as traces. In the presence of target AFP, the sandwiched immunocomplexes were
5、 formed between primary antibodies on magnetic beads and detection antibodies on thionine-graphene nanosheets. With the aid of an external magnet, the formed immunocomplexes30were attached onto a man-made magnetic electrode. The electrochemical signal was produced by the carried thionine redox tags.
6、 Under optimal conditions, the electrochemical immunoassayexhibited a wide working range from 0.1 to 100 ng/mL with a detection limit of 0.06 ng/mL AFP at S/N = 3. The precision and reproducibility of the immunoassay were acceptable. The assay was evaluated for clinical serum samples, receiving in e
7、xcellent accordance with results obtained from35Elecys 2010 Electrochemiluminescent (ECL) Automatic Analyzer.Keywords: analytical chemistry; magneto-controlled electrochemical immunosensing; magnetic beads; thionine-graphene nanosheets; fetoprotein0引言40肿瘤标志物是肿瘤(癌)细胞本身存在或分泌的特异性物质,绝大多数存在于恶性肿瘤 中,肿瘤表面抗原
8、是研究进展较快的指标。甲胎蛋白,作为一种糖蛋白,在正常的情况下, 主要来自于胚胎的肝细胞,它在人血清中正常的含量一般低于 20 ng/mL。但是当肝细胞发基金项目:教育部博士点基金(20103514120003);国家自然科学基金(21075019);福建省自然科学基 金(2011J06003)作者简介:林幼秀,(1990-),女,硕士生,主要研究方向:纳米及生物传感。通信联系人:唐点平,(1972-),男,教授,主要研究方向:生化分析与生物传感。E-mail:dianping.tang- 2 -生癌变时,它的含量将会急剧增加,因此,甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标1。目前,临
9、床上对甲胎蛋白的检测方法主要包括化学发光法、酶联免疫法、酶标电45泳法和放射免疫法等。其中,免疫分析是利用抗原-抗体特异性反应来测定痕量物质的一种 高灵敏度、高选择性的方法,已广泛应用于生命分析、环境监测、疾病诊断等领域2。但是, 现有的免疫分析方法往往存在制备复杂、耗时长、灵敏度低等缺点,而且相对局限于对晚期 肿瘤的诊断,一些早期肿瘤往往成为“漏网之鱼”。因此人工设计具有高灵敏、快速、有效 的肿瘤标志物检测体系,是化学、材料学、生物医学等领域的科研工作者热切追求的目标和50面临的巨大挑战。 电化学免疫分析是将免疫技术和电化学检测相结合的一种免疫分析新方法。在电化学免疫分析中,背景信号的减少、
10、响应信号的增大是构建性能优良的传感器较为关键的技术3。 对于 2 价或 2 价以上的抗原的检测,双抗体夹心免疫分析法是最常用的方法。其中,第二抗 体的标记是夹心免疫分析法的关键所在。石墨烯(graphene)是一种由碳原子构成的单层片55状结构的二维材料。与其他纳米材料相比,石墨烯的理论比表面积非常高(2600 m2/g), 具有突出的导电性能 3000 W/(mK) 和力学性能(1060 GPa),以及室温下的高速电子迁 移率15000 cm2/(Vs)4。同时石墨烯的特殊结构,使其具有完美的量子隧道效应、半整数的 量子霍尔效应、从不消失的电导率等一系列性质,这些独特的性能就为电化学免疫传感
11、的构建提供了以诱人的锲机。因此,本文的主要目的就是利用石墨烯的比表面大、吸附能力强等60特点,将信标抗体和电活性物质-硫瑾固定到石墨的表面,用于第二抗体的标记。 除此之外,电化学免疫分析模式的构建也是提高灵敏度和便利性的有效途径。高灵敏的“Bio-barcodes”免疫分析模式就是电化学免疫传感研究的热点之一5。与电化学免疫传感器相 比,该方法具有检测成本低、耗时短、制备简单、操作方便、通量高等显著优点。磁控电化 学纳米生物传感就是将基于磁性纳米的“Bio-barcodes”免疫分析模式与高灵敏电化学相结65合,在外加磁场作用下,实现样品在复杂体系中的快速分离与检测。这种方法需要将原始抗 体固
12、定在磁性微粒上作为探针,纳米颗粒或酶标第二抗体作为检测抗体(也就是“信标抗 体”),形成的夹心免疫复合物用于高灵敏电化学方法的检测6。由于纳米颗粒的量子尺寸 效应和表面效应,可把生物分析提高到新的水平,使其不仅检测的速度快、精度高、可靠性 好,还能实现多功能化和选择检测。70本文就是将生物分子功能化磁性纳米探针和多功能纳米材料标记技术与高灵敏电分析 方法相结合,在外加磁场作用下实现样品在复杂体系快速分离与检测,建立一个检测成本低、 耗时短、通量高的电化学检测系统。首先,以环氧硅烷作为交联剂,将单克隆甲胎蛋白抗体 固定到磁珠表面,构建一种磁性免疫传感探针,实现对样品中甲胎蛋白的检测。同时,利用
13、硫瑾与石墨烯直接的 - 共轭反应,将具有电化学活性的硫瑾吸附到石墨烯的表面,用于第75二抗体的标记。在目标分析存在下,这种功能化的石墨烯纳米复合物就会固定到磁珠的表面, 形成一种三维的网状结构,在外加磁场的作用,该纳米复合物就会吸附到磁性电极的表面, 由于电子媒介体-硫瑾的摄入,从而导致电化学信号的改变,其信号的大小就会与样品中抗 原浓度的多少有关。1实验部分801.1 仪器与试剂电化学工作站 EC550(武汉高仕睿联科技有限公司);紫外-可见吸收光谱(UV-vis 1102,- 8 -859095100105110115120上海天美科学仪器有限公司);KQ-218 型超声波清洗器(昆山市超
14、声仪器有限公司);Starter3C pH 计(上海奥豪斯仪器有限公司);离心机 CT14RD(上海天美科学仪器有限公司); 电子天平 CP 214(上海奥豪斯仪器有限公司);振荡器 IKA MS 3(德国 IKA 公司);投 射电子显微镜(TEM, JEOL JSM-6700F);ELISA 酶标仪(DNM-9602,北京普朗仪器有限 公司)。单克隆甲胎蛋白抗体(Ab1)、多克隆甲胎蛋白抗体(Ab2)、AFP 酶联免疫试剂盒和 甲胎蛋白(AFP)标准品(均来自于郑州博赛生物技术有限公司);硫瑾(Thi)、牛血清 白蛋白(BSA)、3-环氧基硅烷(GOPS)(均来自于 Sigma-Aldric
15、h);磁珠 Fe3O4 (MB, 直径约 100 nm)(德国柏林 Chemicell GmbH);其他试剂均为分析纯;所有水均为二次去 离子水;磷酸盐生理缓冲溶液(PBS, pH 7.4)的配制: NaCl 8.0 g, Na2HPO4 1.15 g, KH2PO4 0.2 g, KCl 0.2 g, 配成 1000 mL 溶液;不同 pH 的 0.1 M 醋酸缓冲溶液(ABS)是通过 0.1 M HAc 和 0.1 M NaAc,以及 0.1 M KCl 配制而成;临床血清样品来自于福建省立医院。1.2 磁性免疫传感探针制备Ab1 交联磁珠的方法是参照我们先前的报道5。其制备方法主要包含以
16、下几步:(1)使 用外加磁铁将磁珠分离、清洗,于 80 C 的烘箱中干燥 1 h;(2)取 250 mg 磁珠于 7-mL 的离心管中,将 4.75 mL 干甲苯和 250 L GOPS 加入其中,在室温下于振荡器上来回震荡 6 h,使 GOPS 共价交联到磁珠的表面;(3)磁性分离、纯化,使用甲苯和乙醇各清洗三次, 然后将 GOPS 功能化的磁珠置于烘箱中于 80 C 在氮气保护下干燥 1 h 后,冷却、待用;(4) 将 2 mL PBS 稀释的单克隆甲胎蛋白抗体(100 ng/mL)注入到磁珠里面,置于 4 C 冰箱中 轻微震荡 12 h,通过环氧基团与氨基之间的相互作用,将抗体(Ab1)
17、共价交联到磁珠的表 面,磁性分离、清洗、待用;(5)将制备得到的磁性免疫传感探针(Ab1-MB)保存到 10 mL pH 7.4 PBS + 1.0 wt % BSA + 0.1 wt % NaN3 溶液中(目的:使 MB 的含量约为:25 mg/mL) 于 4 C 冰箱中,保存待用。1.3 抗体-硫瑾-石墨烯纳米复合物的制备氧化石墨烯的制备是根据我们以前的报道7,8,抗体和硫瑾修饰到氧化石墨烯的表面是 采用了“一锅法”:10 mg 氧化石墨烯首先加入到 50 mL 去离子水中,在室温下连续超声30 min,取出,离心 5 min(3000 rpm)(目的:去除未溶解的氧化石墨烯),取其上清液
18、于另一离心管中,再次离心 10 min(12,000 rpm),将其沉淀物溶于 2 mL 去离子水中,充 分震荡,使其均匀分散溶液中,然后,将 2 mL 硫瑾水溶液(2 mM)和 1.0 mL Ab2 抗体溶 液(500 ng/mL)加入到氧化石墨烯混合溶液中,在 4 C 冰箱中轻微震荡 12 h,使硫瑾和 Ab2 抗体吸附到氧化石墨烯的表面,随后,200 L 80 wt % 肼滴加到该混合物中,轻微震荡1 h,离心分离 10 min(12,000 rpm),制备得到抗体-硫瑾-石墨烯纳米复合物(Ab2-Thi-GP),将其溶解到 5 mL pH 7.4 PBS + 1.0 wt % BSA
19、+ 0.1 wt % NaN3 溶液中于 4 C 冰箱中,保存待 用。1.4 电化学测量过程示意图 1 为 Ab1-MB、Ab2-Thi-GP 以及夹心免疫复合物的构建过程。自制磁性电化学检 测池被示意图显示在我们以前的报道中9。电化学测量过程采用传统的三电极体系:检测底 部的金片作为工作电极,饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝作为对电极。电化学测量过程主 要包含:(1)将 25 L 不同浓度的 AFP 标准品或样品与 25 L Ab1-MB(25 mg/mL)悬浮精品论文125130液于离心管充分混合,在室温下反应 25 min,磁性分离,去除未反应的 AFP;(2)将 25 LAb2-Thi-
20、GP 悬浮液加入到该离心管中,于室温下充分混合反应 25 min,离心分离,去除未 反应的 Ab2-Thi-GP;(3)2 mL pH 5.5 ABS 加入到该夹心免疫复合物中,混合溶解,转移 到磁性电化学检测池中,在外加磁铁的作用下,免疫复合物被固定到金电极表面;(4)采 用线性扫描伏安法(LSV)进行电化学测量(电位范围:0.2 -0.5 mV;扫速为:50 mv/s)。示意图 1 磁控电化学免疫传感的构建过程Scheme 1 Fabrication process of magneto-controlled electrochemical immunoassay protocol2结果与
21、讨论1351401451502.1 磁控电化学免疫传感的构建过程及其测定原理在本实验中,两种纳米标记探针被制备:一种是磁性免疫传感探针,用于对目标分析物 的捕获;另一种是具有氧化还原特性的石墨烯纳米信标探针,用于电化学信号的产生。这种 磁性纳米标记探针的构建就有利于样品的快速分离与富集,适合在复杂体系中样品的检测。 捕获抗体(Ab1)被交联到磁珠上是通过 GOPS 上环氧基团与抗体上的氨基基团的共价反应, 这种交联方法已经在我们以前工作中进行了报道5,6,10。硫瑾,作为一种正电荷的分子,能 够通过正负相反电荷吸附固定到负电荷的氧化石墨烯上,同时,它们也能够通过 - 共轭将 硫瑾固定到石墨烯的
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