人教版教学课件基因工程基本操作程序.ppt

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1、1.2 基因工程的基本操作程序,团风中学 吴建兵,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,阅读教材P8-11,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。,1、从基因文库中获取目的基因,（1）.基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受

2、体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游的RNA聚合酶结合位点:,启动子,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,

3、终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,与RNA聚合酶结合位点,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,转录,翻译,转录,翻译,1下列关于基因结构的认识中，正确的是（）A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子C大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的下游D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列2（多选）原核细胞

4、与真核细胞基因结构的共同特点是（）A编码区都有能编码蛋白质的序列B编码区都是连续的C非编码区都能调控遗传信息的表达D非编码区都有RNA聚合酶结合的位点,D,ACD,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,（2）.基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA文库的构建-逆转录法：,mRNA,RNADNA杂合双链,单链DNA,双链DNA,逆转录,（

5、cDNA）,DNA聚合酶,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码系列。即不含非编码区和内含子,（3）构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,

6、（4）从基因文库中得到目的基因的方法,直接分离法(鸟枪法),直接分离法,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(鸟枪法),回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些？,多用于原核生物,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,受体菌群体,与运载体连接导入,部分基因文库（cDNA文库）,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,某种生物某个时期的mRNA,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,构建基因组DNA文库时

7、，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA,目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,2、利用PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,5,3,DNA复制的条件：模板DNA、脱氧核苷酸、解旋酶、引物酶、DNA聚

8、合酶、DNA连接酶,PCR技术,原理：前提：原料：优点 过程：,PCR扩增仪,DNA复制,已知目的基因的一段核苷酸序列,：以_方式扩增，在短时间内大量扩增目的基因,指数,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子,变性,复性,延伸,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,过程：,PCR反应体系中目的

9、基因成指数(2n)形式扩增,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,条件：_、_、_、_、前提条件:_,结果：,模板DNA(含目的基因),四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,使_在短时间内成百万倍地扩增,已知基因的核苷酸序列,含目的基因的DNA片段,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋变复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内

10、的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等,?,1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？,2（2n-1）(n为循环次数),（24-1）2=30,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,人工合成法（真核生物）,推测,推测,单链DNA,合成,那么原核生物和真核生物基因结构有没有

11、区别呢？,一、目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,课堂小结：,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A.B.C.D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,3、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA

12、扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个,A.540 B.8100 C.17280 D.7560,加热至95摄氏度的目的是使DNA中的 断裂，这一过程在细胞内是通过 解旋酶 的作用来完成的。当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料，遵循的原则是。Taq酶的特点是（）A.耐强酸 B.耐强碱 C.耐高温 D.最适温度37摄氏度4.请指出PCR技术与DNA复制过程的区别,在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予

13、的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温A BC D,D,在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个,B,在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法 B、基因组文库法C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因

14、 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B C D,A,D,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,基因表达载体的构建,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,Hin d限制性酶,目的DNA,质粒,构建表达载体,四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因,DNA连接

15、酶,人类胰岛素的基因,2.基因表达载体的组成：,它们所处的位置和有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,3、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能

16、比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化

17、学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A BC D,（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,D,下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视

18、受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,常用的受体细胞：,原核生物：大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌真核生物：酵母菌和动植物细胞,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,将目的基因导入受体细胞,转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,整合到染色体上,转移至受体细胞,（2）基因

19、枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,常用于单子叶植物的转化方法,（2）基因枪法微弹轰击法,特点：成本高,适用于单子叶植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的

20、基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,早期胚胎,新性状动物,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,将目的基因导入受体细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理,比较目的基因导入不同细

21、胞的方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca2+处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定 抗病鉴定活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂

22、交法,DNA分子杂交法,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,个体水平的鉴定,目的基因的表达和检测,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起

23、，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P15思考与探究,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因

24、 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质 A B C D,C,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A B C D,C,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理目的基因的检测与鉴定检测：

25、是否插入、转录、翻译鉴定：,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和。（4）为了确

26、定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,C,基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A、人工合成目的基

27、因 B、目的基因的检测和表达C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因与运载体结合,（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,培养,培养,培养,导入,含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌,含有氨苄青霉素 的完全培养基,含有四环素的完全培养基,两种培养基均不能生长大肠杆菌,Ca2+处理细胞形成感受态细胞,检测,（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）,只有氨苄青霉

28、素抗性基因质粒,只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌,不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌,完全培养基,导入,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,存活,导入,接种培养,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌含抗四环素基因,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,