牙鲆 CYP19A 基因启动子 CpG 富集区突变.doc
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1、精品论文牙鲆 CYP19A 基因启动子 CpG 富集区突变对繁殖内分泌的影响何峰,马瑞芹,丁玉霞,温海深,李吉方5(中国海洋大学水产学院,山东 青岛 266003)摘要:P450 芳香化酶是催化雄激素转化为雌激素的关键酶和限速酶。利用 PCR-SSCP 技术 检测牙鲆 CYP19A 基因启动子 CpG 富集区单核苷酸多态性(SNPs),并分析了突变位点对 牙鲆繁殖内分泌的影响。结果在 2 个 CpG 富集区(P1、P2 和 P3)发现 31 个 SNPs。经过多 重比较分析发现,P1 位点与雌鱼血浆雌二醇(E2)水平和雄鱼性腺指数(GSI)存在显著性10关系(p0.05);P2 位点与雄鱼血浆
2、睾酮(T)水平和肝重指数(HSI)呈显著性相关(p0.05)。 这 2 个突变区域都与牙鲆的繁殖性能存在显著性相关。通过此研究为牙鲆的分子育种和繁殖 调控提供一些有价值的参考信息。关键词:牙鲆;CYP19A 基因;SNP;繁殖内分泌中图分类号:S91715Polymorphism in the CpG rich region of the CYP19A gene promoter affecting the reproductive endocrine of Japanese flounderHe Feng, Ma Ruiqin, Ding Yuxia, Wen Haishen, Li Jif
3、ang20(Fisheries College, Ocean University of China, 5 Yushan Road, ShanDong QingDao 266003) Abstract: Cytochrome P450arom is a key component of the enzymatic aromatase complex converting androgens to estrogens. The protein that catalyzes the aromatization of steroid hormones is encoded by the CYP19
4、gene. The aims are to detect polymorphism in the CpG rich region of the CYP19A gene promoter and analysis its effect on reproductive endocrine of25Japanese flounder. Three blocks (P1 and P2) including 31 SNPs were identified in the promoter region of CYP19A gene of Japanese flounder. Multiple compar
5、isons revealed that P1 wasassociated with serum E2 level in female individuals and GSI in male individuals (p0.05). And P2 had significantly associations with serum testosterone (T) level and HSI in male individuals (p0.05). All the three blocks had significantly association with the reproductive en
6、docrine of30Japanese flounder. The results would provide some valuable information for the marker assistedbreeding and reproductive regulation of Japanese flounder.Keywords: Japanese flounder; CYP19A gene; Polymorphism; Reproductive endocrine0引言35P450 芳香化酶(CYP19)是细胞色素 P450 家族中重要的一员,它是催化雄激素转化为 雌激素的末端
7、酶。在鱼类的性腺发育、卵巢滤泡发育、性别分化、维持第二性征等繁殖内分 泌活动中发挥着非常重要的作用1-4。众所周知,基因调控区可以调控基因的表达,如果调 控区序列发生突变,则可能会对基因的表达产生影响。CYP17 基因启动子区的突变 T-34C 正好位于 Msp AI 酶切位点,研究表明该突变与高加索男性的骨大小有关,但在其他人种内40未发现类似报道5,6。牛 TG 基因启动子区的突变 G82A 与牛的宰前活体质量和眼肌面积显著 相关(p0.05)7。Galay-Burgos 8等(2006)克隆了狼鲈 CYP19A 基因调控区,通过 cDNA 序列比对发现存在 3 个 SNPs。牙鲆 CYP
8、19A 基因编码区存在 2 个 SNPs 位点,其中 T993G 位点与牙鲆血浆雌二醇(E2)基金项目:高等学校博士学科点专项新教师基金(20090132120006)资助作者简介:何峰,(1974-),男,硕士研究生导师,鱼类繁殖生理与表观遗传学。E-mail: hefengouc- 7 -含量和性腺指数(GSI)存在显著性关系(p0.05)9。牙鲆 CYP19A 基因部分启动子区序45列(-720bp-30bp)(Genebank NO.AB303853)的 SNP 检测已经报道10。对新克隆获得的 牙鲆 CYP19A 基因启动子区序列(-2242bp-721bp)(Genebank NO
9、. AB304921)的 SNP 分 析未见报道,本研究以人工养殖牙鲆为实验鱼,检测了雌雄鱼 CYP19A 基因新克隆获得的启 动子区的 SNP,并分析了多态位点对牙鲆繁殖内分泌的影响。1材料和方法501.1实验动物此实验用牙鲆采自山东科合海洋高技术有限公司。在其工厂化养殖池塘内放养牙鲆 300 尾(20.383.71g),控制水流、充氧量、温度、光照、投饵量(4 mg/LO2、200.5、光 照时间 14L:10D)。饲养六个月后选取 150 尾牙鲆(242.1730.76g)运回实验室,在相似 的饲养条件下暂养一周后采集样品腺取出后,一部分组织迅速用 Bouin 氏液固定用于组织学55研究
10、,另一部分存放在-80用于基因组 DNA 的提取。1.2繁殖性能测定1.2.1放射免疫测定(RIA)方法测定血浆性激素含量 根据温海深(2008)11等激素测定方法,采用 I125 标记的放射免疫分析法测定(RIA)方法测定雌鱼血浆中睾酮(T)和雌二醇(E2)含量。601.2.2性腺指数和肝重指数 生物学指标包括体长,体质量,性腺质量,去内脏质量。计算性计算性腺成熟系数(GSI)=GW/( BW-VW)100,肝重指数(HSI)=LW/BW100。(BL:体长; LW:肝质量;BW:体质量;LW:肝重量;GW:性腺质量;BW-VW:去内脏质量;GSI:性腺指数;HIS:肝脏指数)。651.3主
11、要试剂所有试剂有 RNAiso Reagent ( TaKaRa 公司)、RNA 酶抑制剂(TaKaRa 公司)、M-MLV 逆转录酶(Promega 公司)、Taq 酶(TaKaRa 公司)、dNTPs 和 PCR 产物回收试剂盒等从北京天 根公司购买,克隆子测序由华大基因公司完成。1.4CYP19A 基因的引物设计70根据牙鲆 CYP19A 基因启动子区序列(-2242bp-721bp)(Genebank No. AB304921), 利用 Oligo 6.0 软件设计引物,共设计六对引物,由上海生工生物工程有限公司合成(如表 1)。表 1 CYP19A 基因启动子区引物序列Table 1
12、 Primer sequences and information of Japanese flounder CYP19A promoter region引物引物序列长度退火温度PrimerSequencesLength(bp)Tm()Primer1TCGAGGCCAAGGACAGAAAGAT CTGGGAATTTCCTGAGCAGCATPrimer2AAGACGCTTGTGGAATGTTCCCTGCCTGGAGAACGATGCCCTATPrimer3GGTTCTCTGCGCTATCATGCAG ATGCTCTCTGGCTTAGGTCCTGPrimer4AGAGAGAGCAAATGGAACAA
13、AG GTTTCTACTGTGGAACTTGTGTPrimer5ACACAAGTTCCACAGTAGAAAC TACTACTGTTGCTGAGCTCTTT2916031060150593806029359752结果2.1PCR 扩增和 PCR-SSCP 结果将引物 1 的 PCR 扩增产物进行 SSCP 电泳,经检测发现引物 1 的 PCR 扩增片段共存在 三种基因型,根据后续的测序实验将这三种基因型分别定义为 P1-1、P1-2、P1-3。1、2、3、5、8、11 为 P1-1 基因型,6、10、12 为 P1-2 基因型,4、7、9、13 为 P1-3 基因型。SSCP80检测结果及三种基
14、因型的定义如图 1 所示。图 1 引物 1 的 SSCP 图及分型Fig .1The SSCP result of primer1 of the CYP19A gene promoter sequence85从引物 4 的 SSCP 电泳结果中可以看出,引物 5 的 PCR 扩增产物也存在三种基因型, 分别定义为 P2-1、P2-2、P2-3。1、3、7、10 为 P2-1 基因型,2、4、5、9 为 P2-2 基因型,6、8 为基因型。如图 2 所示为引物 4 的 SSCP 的检测结果及三种基因型的定义。图 2 引物 4 的 SSCP 图及分型90Fig 2 The SSCP result
15、of primer4 of the CYP19A gene promoter sequence2.2不同引物的各基因型的序列分析结果将 SSCP 图中呈现多态性的个体重新进行 PCR 扩增,然后将扩增产物经过胶回收、连 接、转化后,选择阳性克隆送至北京华大基因公司测序。测序结果进一步证实了多态位点的95存在。经过测序发现,牙鲆 CYP19A 基因启动子区的引物 1 共有四个连锁突变位点,分别为A-2200G 、C-2180T 、A-2126G、A-1997G。突变位点的位置及突变类型如表 2 所示。100位点 基因型表 2 引物 1 的测序结果Table 2 The sequencing re
16、sult of Primer 1-2200bp-2180bp-2126bp-1997bpP1-1GCA A P1-2ATGG P1-3ACG A105从表 3 中可以看出,CYP19A 基因启动子区第 4 对引物共存在 27 个连锁突变位点,分别 为 突 变A-1257T 、 AAAAAT-1252-1245插 入 或 缺 失 、 A-1216G 、 AATGAAATTTA-1213-1203 插入或缺失、T-1202C、TAA-1093-1091C、A-1014G、T-1001C、 C-987T、A-980C。表 3 引物 4 的测序结果Table 3 The sequencing resu
17、lt of Primer 4基因型 位点P2-1 P2-2 P2-3-1257bp-1252-1245bp-1216bp-1213-1203bp-1202bp-1093-1091bp-1014bp-1001bpAAAAAAT A A TAA ATAAAAAAT A C TAA ACT T AATGAAATTTA AC G T-987bp-980bpCACATC1101152.3不同 SNPs 与牙鲆繁殖性状的关联分析在本研究中检测到牙鲆 CYP19A 基因启动子区存在三个突变区域,共 31 个 SNPs。将这2 个突变区域与牙鲆的四个繁殖性状进行关联分析,结果如表 4 所示。结果表明:雌性牙鲆
18、, P1 位点对血浆雌二醇(E2)水平的效应均达到了显著水平(p0.05),其中 P1 位点达到了 极显著水平(p0.01)。 P2 位点则对性腺指数(GSI)的效应达到显著水平(p0.05)。雄 性牙鲆,P1 位点对性腺指数(GSI)达到了显著水平(p0.05)。P2 位点对于血浆睾酮(T) 含量和肝重指数(HSI)均达到显著水平(p0.05)。表 4 CYP19A 基因启动子区 SNPs 与牙鲆繁殖性状的关联分析Table 4 Associations between each of SNPs of Japanese flounder and reproductive traitsP1 位
19、点 P2 位点F ValueP ValueF ValueP ValueT (ng dL1)0.200.81742.330.1068E2(pg mL1)6.140.0038*1.400.2550FemaleHSI (%)0.870.42481.710.1892T(ng dL1)0.140.87313.410.0426*E2(pg mL1)1.790.18052.240.1190MaleHSI(%)0.470.62743.690.0335* GSI (%) 1.97 0.1492 21.83 .0001* GSI(%) 3.98 0.0264* 1.00 0.3757 注: *p0.05, * p
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