龙葵多糖糖蛋白对人乳腺癌 MCF7 细胞周.doc

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1、精品论文龙葵多糖糖蛋白对人乳腺癌 MCF-7 细胞周期的影响季宇彬1,2，高世勇1,2，邹翔1,2，汲晨锋1,2，东方1,2，于淼1,2，袁会成1,2，刘家源1,25（1. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2. 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076）摘要：目的研究龙葵多糖糖蛋白(SNG)对人乳腺癌细胞 MCF-7 细胞周期的影响。方法以150g/mL、300g/mL、600g/mL 三种浓度龙葵多糖糖蛋白作用于 MCF-7 细胞 48h，通 过 PI 染色流式细胞术检测龙葵多糖糖蛋白对 MCF-7 细胞周期的影响；Western Blot

2、法检测10其对周期蛋白 CyclinB1、周期蛋白依赖性激酶 CDK1 表达。结果龙葵多糖糖蛋白各给药 组作用于 MCF-7 细胞 48h 后，细胞 G2/M 期比例逐渐增加，其余两期比例减少，并呈剂量 依赖性；细胞周期蛋白 CyclinB1 和细胞周期依赖性蛋白激酶 CDK1 的蛋白表达升高。结论 龙葵多糖糖蛋白通过上调人乳腺癌 MCF-7 细胞内 CyclinB1 和 CDK1 蛋白的表达，从而将细胞周期阻滞于 G2/M 期。15关键词：龙葵多糖糖蛋白；MCF-7；细胞周期中图分类号：R96Effects of Solanum nigrum glycoprotein on cell cyc

3、le ofMCF-720Ji Yubin1,2, Gao Shiyong1,2, Zou Xiang1,2, Ji Chenfeng1,2, Dong Fang1,2, Yu Miao1,2, Yuan Huicheng1,2, Liu Jiayuan1,2(1. Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, HarbinUniversity of Commerce, Harbin 150076;2. Engineering Research Center of natural a

4、ntineoplastic drugs，Ministry of Education,25Harbin 150076)Abstract: Objective To study the effect of mechanism of cell cycle to arrest human breast cancer cells MCF-7. Methods After 48 h of exposure to SNG(150, 300 and 600 g/mL), the cell cyclewas detected by flow cytometry (FCM). The expressions of

5、 CyclinB1 and CDK1 proteins were examined by Western blot. Results G2/M phase cell percentages of all dose groups of SNG were30increased compared with the control group. The expression of CyclinB1 and CDK1 proteins were significantly up-regulated compared to the control in a dose-dependent manner (P

6、0.01 or P 0.05). Conclusion SNG can induce G2/M arrest in MCF-7 cells through up-regulation of the expressions of CyclinB1 and CDK1 proteins.Keywords: Solanum nigrum glycoprotein; MCF-7; Cell cycle350引言糖蛋白是一类由糖和多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白。糖蛋白能够抗肿瘤主 要有两方面的原因，一方面是糖蛋白能够提高免疫力，来增强机体各方面的功能，从而达到 抗肿瘤的目的；另一方面糖蛋白抗肿瘤主

7、要是能够抑制肿瘤细胞，诸多的细胞实验能够证明。40文蛤糖蛋白1对人肺癌(A549)、卵巢癌(HO8910)等肿瘤细胞的生长均有很强的抑制作用，而 对正常脾淋巴细胞无抑制作用，可以选择性地杀伤肿瘤细胞，而不影响正常体细胞的生长。 黄蘑糖蛋白2和甘薯糖蛋白3提取物对 H22 荷瘤小鼠都具有一定的抗肿瘤作用。韩国学者4研究发现龙葵糖蛋白对 MCF-7 和 HT-29 细胞有抑制作用。能够通过抑制 NF-基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20102332110001） 作者简介：季宇彬，(1956-)，男，教授，主要研究方向：天然药物化学。 通信联系人：高世勇，（1975-），男，教授，肿瘤药

8、理。E-mail: sygao2002- 6 -B 蛋白的活性和阻断蛋白激酶的跨膜易位，而使 NF-B 和活化剂蛋白-1 的 DNA 结合后45活性降低，进而阻断了 NF-B 抗凋亡通路。中药龙葵为茄科茄属植物龙葵(Solanum nigrum Linne)的全草，其在世界各国均有分布， 龙葵味苦，性寒，微甘。有清热解毒、活血化癖、利水消肿、止咳祛痰的功效5。化学研究 发现，龙葵全草及未成熟的果实中含苷类甾体生物碱、多糖、糖蛋白、矿物质、维生素、色 素等活性成分，龙葵浆果提取物中还含有酯、羧基化合物、甾醇、酚性化合物等成分6。 现50代药理学研究表明，龙葵具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗休克、抑菌

9、等作用，龙葵糖蛋白是 其有效成分之一7。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞55人乳腺癌 MCF-7 细胞株，由哈尔滨商业大学药物研究所传代保种。1.1.2药物与主要试剂龙葵多糖糖蛋白由哈尔滨商业大学药物研究所提供（糖 27.24%，蛋白 46.39%）。龙葵 多糖糖蛋白粉末用 RPMI 1640 培养液配制成 5mg/mL 的母液，用封口膜封口，20保存， 给药前室温溶解，以 RPMI 1640 培养液稀释到所需浓度。RPMI1640 和胰酶， Gibco 公司；60胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，碘化丙啶（PI），美国 Sigma 公司；预染蛋 白 Marker、Western

10、及 IP 细胞裂解液，碧云天生物技术研究所；兔抗 CyclinB1 和鼠抗 CDK1， 博士德生物公司。1.1.3仪器CKX41 倒置显微镜，Olympus 公司；EPICS XL 型流式细胞仪，美国 Beckman-Coulter65公司；低温高速离心机，美国 Beckman-Coulter 公司；680 型全自动酶标仪，美国 Bio-Rad公司；电泳仪、电转仪，北京六一仪器厂；GIS-2019 凝胶成像系统，Tannon 公司。1.2方法1.2.1细胞培养及给药MCF-7 细胞株常规方法复苏后，培养于含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中，置培70养箱（37，体积分数为 5%

11、CO2，相对湿度 95% )培养，每 23 d 传代 1 次，取对数生长 期细胞，设龙葵多糖糖蛋白的浓度分别为 150，300，600g/mL；阳性药阿霉素的浓度为1g/mL，阴性对照组(加相同体积的培养液 RPMI 1640)，进行后续实验。1.2.2流式细胞仪检测 SNG 对 MCF-7 细胞周期的影响将浓度为 2105 个/mL 对数生长期细胞接种于 6 孔培养板，每孔 1mL，置培养箱内培75养 24 h 后加入不同浓度的龙葵多糖糖蛋白，药物作用 48h 后，PBS 洗 2 次，加入 1mL 胰酶 消化，消化后加入 2mL 培养基，收集细胞，离心弃上清液；用质量分数为 70预冷的乙醇4

12、固定 12h，离心弃固定液，加入 2mLPBS 吹洗，离心后弃上清液；加入配好的 PI 染液， 常温下孵育 30min，再用 300 目网过滤后，进行流式细胞仪检测，激发波长 488 nm，发射 波长 525nm8。实验平行三次。801.2.3Western Blot 法分析 SNG 对 MCF-7 细胞 CyclinB1 和 CDK1 表达量的影响处理细胞和实验分组同 1.2.1。提取总蛋白和胞浆蛋白，采用 Bradford 法计算蛋白含量， 各组取等量蛋白进行 12%SDS-PAGE 电泳并转移到 NC 膜上，膜用含 5%脱脂奶粉 TTBS 4封闭非特异结合位点 2h，将膜与稀释的一抗 4

13、冰箱中孵育过夜，TTBS 液充分洗膜 3 次， 每次振摇 10min。再与二抗室温孵育 2h。冲洗未结合的二抗，TTBS 摇洗 3 次，每次 10min。85取出 NC 膜用 DAB 显色系统显色，Tannon 凝胶成像系统照相。扫描图像在天能 GIS 凝胶成 像分析系统进行半定量分析。1.2.4统计学处理实验均重复 3 次，数据结果均以 x s 表示，并采用 SPSS 15.0 for windows 统计软件分 析，组间均数比较采用单因素方差分析。902结果2.1流式细胞仪检测 SNG 对 MCF-7 细胞周期的影响实验结果如表 1 和图 1 所示，150，300，600g/mL 的龙葵多

14、糖糖蛋白作用 MCF-7 细胞48h 后，与空白对照组比较，G2/M 期比例逐渐增加，其余两期比例减少。可见龙葵多糖糖 蛋白作用于 MCF-7 细胞可导致 G2/M 期阻滞，并且其阻滞强度呈现剂量依赖性。95表 1 SNG 对 MCF-7 细胞周期的影响GroupDose/(g/mL)G0/G1(%)S(%)G2/M(%)阴性对照组-56.620.1833.780.389.600.24阿霉素1.56.130.1612.100.1981.770.5*SNG 低剂量组15052.191.4131.330.4116.480.62*SNG 中剂量组30050.811.1530.350.8918.841

15、.58*SNG 高剂量组60049.530.4428.160.6122.311.17*注：*P0.05, *P0.01 vs 阴性对照组100a) Control b) MCF-7 cells treated with 1.5g/mL adriamycinc) MCF-7 cells treated with 150g/mL SNG d) MCF-7 cells treated with 300g/mLSNG105e) MCF-7 cells treated with 600g/mLSNG图 1 不同浓度 SNG 给药 48h 后对 MCF-7 细胞周期的作用2.2Western Blot 法

16、分析 SNG 对 MCF-7 细胞 CyclinB1 和 CDK1 表达量的影响由图 25 可知，不同浓度的龙葵多糖糖蛋白作用于 MCF-7 细胞 48h 后，随着给药浓度 的增加，细胞内 CyclinB1 和 CDK1 的表达量均逐渐增加，差异显著，具有统计学意义。110CyclinB1 58KDa-actin 43KDa controlADR 150g/mL 300g/mL 600g/mL图 2 SNG 对 MCF-7 细胞 CyclinB1 蛋白表达的影响115120图 6-2 龙葵多糖糖蛋白对 MCF-7 细胞中 CyclinB1 表达水平的影响 注：*P0.05,*P0.01 vs

17、阴性对照组CDK1 34KDa-actin 43KDa controlADR 150g/mL 300g/mL 600g/mL图 4 SNG 对 MCF-7 细胞 CDK1 蛋白表达的影响1253讨论图 3 龙葵多糖糖蛋白对 MCF-7 细胞中 CDK1 表达水平的影响 注：*P0.05,*P0.01 vs 阴性对照组130糖蛋白存在于细胞内外的形式主要为与细胞膜结合状态或溶解状态。糖蛋白的含糖量以 及其相对分子质量差异均很大，糖含量从 1到 85不等。其也是生物体内至关重要的具有 生物活性的物质，其蛋白与糖链的相互作用介导了细胞专一性的识别功能，能够调控多种生 命过程，如神经系统的维持、发育、

18、受精等，在目前的炎症及癌细胞异常增殖、自身免疫系 统中也起到了积极的作用。糖蛋白具有以下生物学功能：（1）是构成 构型血抗原的基本 物质，寡糖链的识别作用决定着细胞的识别、集聚和受体作用9；（2）黏膜保护作用；（3） 构成细胞表面受体，与细胞识别有关；（4）与免疫反应及神经传导有关。糖蛋白应用于人 类健康的研究越来越受到重视，目前已有报道糖蛋白具有明显地抗艾滋病及抗肿瘤活性，应 用糖蛋白的靶向性来设计抗肿瘤药物，以及应用其免疫原性而制备的多糖结合疫苗，通过激135140145150155发免疫系统来达到治疗的目的，采用生物疗法提高治疗效果，已然成为治疗癌症的重要手段。龙葵作为传统的中草药，近些

19、年来受到了海内外学者的极大关注。通过对其化学成分的 深入研究，其药效作用的物质基础已渐渐清晰，尤其是在抗肿瘤作用的研究方面已取得了一 系列的研究成果。目前国内研究者认为，龙葵的抗肿瘤机制主要是通过生物碱来改变细胞膜 的结构和功能，影响 DNA 和 RNA 的合成以及改变细胞周期的分布来抑制肿瘤；国外研究 者则以龙葵多糖糖蛋白作为研究对象，其研究显示龙葵糖蛋白10可以抑制氢氧自由基引起 的 NF-B 活性增强，能够有效的提高 HCT-116 细胞内的半胱天冬胺的活性及聚 ADP 核糖 聚合酶的分解，最终引起细胞凋亡，Lee 等认为龙葵糖蛋白可以用做直肠癌化疗药物的替代 品11。细胞周期调控机制的

20、失常是肿瘤细胞发生、发展的重要因素。在有丝分裂的过程中，微 管的解聚是由于有丝分裂促进因子 MPF 磷酸化微管结合蛋白 MAP，导致微管解聚12；当有 丝分裂结束后，纺锤体继而分解为游离态，从而实现动态平衡，受 MAP 和 XKCM1 肌动蛋 白的调控。有丝分裂促进因子 MPF 具有两个亚基单位 CyclinB1 和 P34 cdc2(即 Cdk1)，两者 形成活性化合物，前者为调节亚基，后者为催化亚基。4结论以不同浓度的龙葵多糖糖蛋白处理 MCF-7 细胞 48h 后，均可使周期相关蛋白 CyclinB1 和 CDK1 的表达量上调。这可能是在有丝分裂过程中，龙葵多糖糖蛋白能够降低微管稳定

21、性的作用，妨碍微管蛋白装配成纺锤体的过程，从而将 MCF-7 细胞周期特异的阻滞于 G2/M 期。参考文献 (References)1601651701751 吴杰连. 文蛤糖蛋白 MGP0501 抗肿瘤作用及其机制的研究D. 南昌：南昌大学, 2006.2 刘主，朱必凤，彭凌，高建林. 甘薯糖蛋白 SPG-1 抗肿瘤及免疫调节作用研究J.食品科学，2007，28（5）：312-316.3 曹瑞敏，吴珊，赵忠伟，等. 黄蘑多糖蛋白的抗肿瘤作用J. 中国中药杂志，1994，19(10）：624-625.4 HEO K S, LIM K T. Glycoprotein isolated from

22、Solarium nigrum L inhibits the DNA binding activities of NF-B and AP-1 and increases the production of nitric oxide in TPA-stimulated MCF-7 cellsJ. Toxicol In Vitro,2004, 18(6): 755.5 李秀霞，张海洋. 龙葵的药理作用及临床应用J. 佳木斯医学院学报，1998，2l(l)：23-25.6 季宇彬，王胜惠，高世勇，等. 龙葵活性成分的研究J. 哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2004，20(6)：637-640.7

23、 安磊，唐劲天，刘新民，等. 龙葵抗肿瘤作用机制研究进展J. 中国中药杂志，2006，31(15)：1125.8 WANG C, CHEN T, ZHANG N. Melittin, a major component of beevenom, sensitizes human hepatocellular carcinoma cells to tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis by activating MKII-TAK1-JNK/p38 and inhibitin

24、g IkappaB alpha kinase-NF kappaBJ. BiolChem, 2009,284(6):3804-3813.9 LEE S J, LIM K T. 150 kDa glycoprotein isolated from Solanum nigrum Linne stimulates caspase-3 activation and reduces inducible nitric oxide producti on in HCT-116 cellsJ. Toxicology in Vitro, 2006, 20: 1088.10 LEE S J, LIM K T. 15

25、0 kDa glycoprotein isolated from Solanum nigrum Linne stimulates caspase-3 activation and reduces inducible nitric oxide producti on in HCT-116 cellsJ. Toxicology in Vitro, 2006, 20: 1088.11 ABDEL A M，ABUEL H A. Increased caspase-3 and altered Expression of apoptosis-associated proteins,bcl-2 and Bax in liehen planusJ. Cline Dermatol, 2009, 34(3): 390-395.12 NOETZEL T L, DREEHSEL D N , HYMAN A A. A comparison of the ability of MAP215 and tau to inhibit the microtubule destabilizing activity of XKCM1J. Trans. R. B,2005, 360: 591-594.