害虫取食和机械损伤寄主植物对棉铃虫谷胱甘肽 S.doc

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1、害虫取食和机械损伤寄主植物对棉铃虫谷胱甘肽 S-转移酶的影响1任怡欣，梁沛，宋敦伦，高希武* 中国农业大学昆虫系，北京（100094） E-mail：gaoxiwu 摘要：本文以棉铃虫为对象，研究了寄主植物棉花、小麦和玉米的挥发物、机械损伤诱导 挥发物和害虫取食诱导挥发物处理对三龄棉铃虫幼虫主要解毒酶系谷胱甘肽 S-转移酶（GSTs）活性的诱导作用。结果表明，三种寄主植物的诱导活性最高分别达到了 2.22、1.67和 3.94 倍；机械损伤寄主植物的诱导活性最高达到了 1.49、1.69 和 2.39 倍；害虫取食寄主 植物的诱导活性分别最高达到了 2.02、1.88 和 3.43 倍。关键词

2、：谷胱甘肽 S-转移酶；寄主植物；诱导活性；棉铃虫在植食性昆虫与寄主植物协同演化过程中，昆虫发生了很多适应性变化，如昆虫对植物 次生物质有很强的解毒能力（管致和，1996）。昆虫体内的谷胱甘肽 S-转移酶(GSTs)就是昆 虫体内重要的解毒酶系之一（高希武等，1997）。GSTs 在异源有毒物质如杀虫剂和植物次生 物质的解毒过程中起着重要作用，因而备受人们关注。吕敏等人（2003）研究发现小菜蛾 GSTs 的高活力是小菜蛾对有机磷类杀虫剂产生抗药性的重要机制之一。植物的各类次生性 物质也能广泛地诱导昆虫 GSTs 的活性增高（董向丽等，1998；汤方等，2005；张常忠等，2001；陈凤菊等，

3、2003）。棉铃虫 Helicoverpa armigera (Hubner)是一个典型的广食性农业害 虫，揭示棉铃虫与寄主植物之间化学适应关系，对于棉铃虫的有效治理具有重要的实践和理 论意义。本文从寄主植物的挥发物，害虫取食寄主植物产生的挥发物以及人为机械损伤寄主 植物产生的挥发物三个方面研究其诱导棉铃虫谷胱甘肽 S-转移酶活性的变化。1. 材料和方法1.1 供试棉花普通棉花品种中棉 35，种子催芽后播种于无菌沙土中（26-30，RH 50-60%）。待两片 子叶展开后，转移到盛有营养液的塑料杯中，在日光温室内培养 2-3 周后供试。营养液配方 为：0.75mM K2SO4, 0.25mM

4、KHPO4, 0.1mM KCl, 0.65mM MgSO4, 2mM Ca(NO4)2,0.1 mM Fe-Na EDTA, 110-2mM H3BO3, 110-3mM MgSO4, 110-3mM ZnSO4,410-4mM CuSO4, 510-6mM (NH4)6Mo2O4。1.2 供试小麦选用普通小麦品种，种子催芽后播于覆有滤纸的培养皿中（26-30，RH 50-60%）。1.3 供试玉米普通玉米品种农大 108，种子催芽后播种于无菌沙土中（26-30，RH 50-60%）。待两 片子叶展开后，转移到盛有营养液的塑料杯中，在日光温室内培养 2-3 周后供试。1.4 供试昆虫1本课题

5、得到国家重点基础研究发展计划(批准号：2006CB102003)；教育部博士点基金(20040019028)；国家 自然科学基金（批准号：30530530，30170621，30471153）的资助。- 5 -棉铃虫 1998 年采自河北邯郸，于室内条件（25，RH 75%，L:D=16:8 h）下用人工饲料长期饲养；棉蚜和麦蚜均为本实验室人工饲养的多代品系饲养温度 25-35，相对湿度60-80%，日光温室自然光周期；玉米螟为中国农科院植保所玉米组提供。1.5 接虫及试验处理选用长势一致的棉苗，预先处理普通棉花苗、机械损伤棉花苗（叶片针刺 50 孔，直径1-2mm）和棉蚜取食棉花苗(每株 5

6、0 头)。每个处理 10 株棉花幼苗。各处理棉苗罩尼龙网， 并在棉苗的塑料杯的外壁贴双面胶，确保棉铃虫在试验中不会爬到棉株取食；麦苗的机械损 伤处理为叶片针刺 20 孔（直径 1-2mm），麦蚜取食麦苗接种量为每株 50 头；玉米苗的处理 同棉花苗，并用 50 头玉米螟取食玉米苗。将上述处理分别放入 4 个容积为 7.5 升的干燥箱中，每个干燥箱中放置足量的人工饲料 后，再接入适量的三龄棉铃虫，每个处理 3 个重复。于 12、24、36、48、72 和 96h 后测定 棉铃虫谷胱甘肽 S-转移酶活性。1.6 酶液的制备取三龄棉铃虫幼虫，在研钵中加入 0.1M 的磷酸缓冲液（pH6.5）冰浴匀浆

7、，4下离心（10,800 rpm, 15min），取上清液作为酶液，于-85冰箱保存或直接用于测定。1.7 GSTs 酶活性测定参照 Habig 等（1981）的方法:在比色皿中依次加入 660L 0.1M pH6.5 的磷酸盐缓冲液，60L 30mM 的谷胱甘肽，120L 酶液，60L30mM 1-氯-2，4-二硝基笨（CDNB）,反应 总体积为 900L，混匀后，用 UV Lambda Bio40 分光光度计记录 2min 内在 340nm OD 值的变化。1.8 蛋白质含量测定参照 Bradford(1976)的考马斯亮蓝 G-250 法，以标准牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白。1.9

8、数据分析计算所得酶活性值用数据处理软件 Instat3 分析。2. 结果与分析2.1 棉蚜取食和机械损伤棉花挥发物对棉铃虫三龄幼虫谷胱甘肽 S-转移酶活性 的影响棉铃虫置于有棉花、机械损伤棉花和棉蚜取食棉花的干燥器中至预设时间间隔后，分别 测得其谷胱甘肽 S-转移酶比活力值如表 1 所示。表 1：不同棉花处理密闭容器内棉铃虫 GSTs 的比活力值Table 1: Specific activity of GSTs in cotton bollworms from air-tight containers maintaining different treated cotton seedings

9、处理时棉花机械损伤棉花棉蚜棉花间比活力相对倍数比活力相对倍数比活力相对倍数time(h)nmol/min/mg proRRnmol/min/promgRRnmol/min/promgRR041.123.28d141.123.28c141.123.28d11256.884.45c1.3835.030.48d0.8560.611.03b1.472468.193.59b1.6661.392.29a1.4982.985.49a2.023630.291.89c0.7452.094.68b1.2748.934.45c1.194891.117.23a2.2258.491.60a1.4262.574.08b1

10、.527288.253.71a2.1558.611.63a1.4360.592.79b1.47注：所有值为三次试验的平均值标准误，同列中相同字母表示差异不显著（P0.05）。Note: Means of three replicates SE，followed by the same letter in the column are not significantly different atP=0.05.从表 1 中可以看出，棉花挥发物、机械损伤诱导棉花挥发物和棉蚜取食诱导棉花挥发物 诱导棉铃虫三龄幼虫 GSTs 活性明显增加，最高分别是对照的 2.22 倍（48h）、1.49 倍（24h）

11、 和 2.02 倍（24h），蚜虫棉花和机械损伤棉花诱导组均为 24h 的 GSTs 活性最高。棉花挥发 诱导组为 48h 的 GSTs 活性最高。棉花挥发物和机械损伤诱导挥发物分别在 36h 和 12h 对棉 铃虫三龄幼虫 GSTs 活性有抑制作用，棉铃虫比活力分别为 30.29 和 35.03 nmol/min/mg pro， 分别为对照的 0.74 和 0.85 倍。2.2 麦蚜取食和机械损伤小麦挥发物对棉铃虫三龄幼虫谷胱甘肽 S-转移酶活性的 影响棉铃虫置于有小麦、机械损伤小麦和麦蚜取食小麦的干燥器中至预设时间间隔后，分别 测得其谷胱甘肽 S-转移酶比活力值如表 2 所示。表 2：不同

12、小麦处理密闭容器内棉铃虫 GSTs 的比活力值Table 2: Specific activity of GSTs in cotton bollworms from air-tight containers maintaining different treated wheat seedings处理时小麦机械损伤小麦麦蚜小麦间比活力相对倍数比活力相对倍数比活力相对倍数time(h)nmol/min/mg proRRnmol/min/promgRRnmol/min/promgRR031.852.73e131.852.73c131.852.73e11234.180.06de1.0747.092.8

13、3a1.4839.732.62d1.252439.191.84cd1.2339.483.65b1.2448.452.42c1.523646.092.50b1.4552.094.68a1.6458.811.50a1.854841.903.61bc1.3248.902.86a1.5259.870.31a1.887253.294.25a1.6753.892.21a1.6953.274.57b1.67注：所有值为三次试验的平均值标准误，同列中相同字母表示差异不显著（P0.05）。Note: Means of three replicates SE， followed by the same lette

14、r in the column are not significantly different atP=0.05.从表 2 中可以看出，小麦挥发物、机械损伤诱导小麦挥发物和麦蚜取食诱导小麦挥发物诱导棉铃虫三龄幼虫 GSTs 活性明显增加；小麦和麦蚜取食小麦处理的棉铃虫幼虫 GSTs 活 性整体上看呈直线上升，机械损伤小麦处理为波浪式上升，最高分别是对照的 1.67 倍（72h）、1.69 倍（72h）和 1.88 倍（48h），但三个处理在 72 小时后 GSTs 活性达到同一水平，为对 照的 1.7 倍左右。小麦挥发物、机械损伤诱导小麦挥发物和麦蚜取食诱导小麦挥发物对棉铃虫幼虫 GSTs各时

15、间间隔均诱导显著，最低也分别是对照的 1.07 倍（12h）、1.24 倍（24h）和 1.25 倍（12h）。2.3 玉米螟取食和机械损伤玉米挥发物对棉铃虫三龄幼虫谷胱甘肽 S-转移酶活性 的影响棉铃虫置于有玉米、机械损伤玉米和玉米螟取食玉米的干燥器中至预设时间间隔后，分 别测得其谷胱甘肽 S-转移酶比活力值如表 3 所示。表 3：不同玉米处理密闭容器内棉铃虫 GSTs 的比活力值Table 3: Specific activity of GSTs in cotton bollworms from air-tight containers maintaining different trea

16、ted corn seedings处理时玉米机械损伤玉米玉米螟玉米间比活力相对倍数比活力相对倍数比活力相对倍数time(h)nmol/min/mg proRRnmol/min/mg pronmol/min/mgRRRRpro022.661.67c122.661.67cd122.661.67d11219.121.58c0.8420.091.70d0.8917.310.98d0.762427.402.60c1.2129.182.67b1.2929.992.71c1.323689.212.28a3.9452.071.66a2.3077.721.55a3.434825.301.71c1.1226.12

17、2.12bc1.1540.673.04b1.797279.737.21b3.5254.093.58a2.3975.165.77a3.32注：所有值为三次试验的平均值标准误，同列中相同字母表示差异不显著（P0.05）。 Note:Means of three replicates SE， followed by the same letter in the column are not significantly different at P=0.05.从表 3 中可以看出，玉米挥发物、机械损伤诱导玉米挥发物和玉米螟取食诱导玉米挥发 物诱导棉铃虫三龄幼虫 GSTs 活性明显增加，最高分别是对照的

18、 3.94 倍（36h）、2.39 倍（72h） 和 3.43 倍（36h）。除机械损伤诱导挥发物在 12 小时对棉铃虫三龄幼虫 GSTs 活性有轻微抑 制作用，棉铃虫比活力分别为 20.09 nmol/min/mg pro，为对照的 0.89 倍。其它玉米挥发物、 机械损伤诱导玉米挥发物和玉米螟取食诱导玉米挥发物对棉铃虫幼虫 GSTs 各时间间隔均诱 导显著。不同玉米处理对棉铃虫幼虫诱导均具有时间效应，12h 内对 GSTs 活性有抑制作用，其 它时间间隔内对 GSTs 均有诱导作用，被诱导 36h 和 72h 后体内 GSTs 活性处于高峰。说明 玉米处理 12h 时间间隔内对棉铃虫产生一

19、定的毒害作用并抑制了酶活；但随着时间的增加， 棉铃虫体内 GSTs 比活力有不同程度的增加，说明棉铃虫加大了对玉米所产生的挥发性次生 物质的代谢，反映了棉铃虫对外界刺激的一种适应机制。3. 讨论本文初步研究了寄主植物棉花、小麦和玉米的挥发物、机械损伤诱导挥发物和害虫取食诱导挥发物对棉铃虫主要解毒酶系 GSTs 的诱导机制，至于酶的诱导机制是表达量发生改变 还是诱导合成新的同工酶，则需要克隆棉铃虫的 GSTs 基因，从转录水平明确植物次生物质 诱导谷光甘肽 S-转移酶后在分子水平上变化的动态。植物次生物质以及寄主植物棉花、小麦和玉米的挥发物、机械损伤诱导挥发物和害虫取 食诱导挥发物，在影响昆虫体

20、内解毒酶的同时通常会伴有昆虫对药剂敏感性的变化。另外， 寄主植物的挥发物、机械损伤诱导挥发物和害虫取食诱导挥发物的组成和含量的差异等还有 大量的工作要做，这对于揭示害虫与寄主植物之间的关系是十分必要的。参考文献1 管致和 植物的防御性次生物质与昆虫 自然科学，1980，845-8512 高希武，董向丽，郑炳宗 棉铃虫的谷胱甘肽 S-转移酶（GSTs）：杀虫剂和植物次生性物质的诱导 与 GSTs 对杀虫药剂的代谢 昆虫学报， 1997， 40（2）：122-1273 吕敏，刘惠霞，吴文君 谷胱甘肽 S-转移酶与昆虫抗药性的关系 昆虫知识，2003，40（3）：204-2084 董向丽，高希武，郑

21、炳宗 植物次生物质对棉铃虫的谷胱甘肽 S-转移酶和乙酰胆碱酯酶的影响 植物 保护学报，1998，25：72-785 汤方，梁沛，高希武 2-十三烷酮和槲皮素诱导棉铃虫谷胱甘肽 S-转移酶组织特异性表达 自然科学进展，2005（7）：33-386 张常忠，高希武，郑炳宗 棉铃虫谷胱甘肽 S-转移酶的活性分布和发育期变化及植物次生物质的诱导 作用 农药学报，2001，3（1）：30-357 陈凤菊，高希武，雷明庆，郑炳宗 单宁酸对棉铃虫谷胱甘肽 S-转移酶的影响 昆虫学报，2003，46（6）：684-6908 Habig W. H. in: Willian B. J.ed. Method in

22、enzymology, New York: Academic press, 1981, 77:398-4059 Bradford M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizingthe principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72:248-254Effects of herbivory and mechanical damage in host plant on

23、induced activity of glutathione S-transferase of Helicoverpa armigera (Hubner)Ren Yixin, Liang Pei, Song Dunlun, Gao XiwuDepartment of Entomology, China Agricultural University, Beijing (100094)AbstractThe induced activity of glutathione S-transferase (GSTs) of Helicoverpa armigera (Hubner) weredete

24、rminated with air-tight containersmaintaining different treated host plant seedings. The results showed that the activity of GSTs were increased by 2.22, 1.67 and 3.94 times respectively induced by hosy plant cotton, wheat and maize, the maximum activity of GSTs were 1.49, 1.69 and 2.39 times induce

25、d by mechanical damaged cotton, wheat and maize respectively, and the maximum activity of GSTs were 2.02, 1.88 and 3.43 times, comparing to the control, induced by cotton aphids, wheat aphids and corn borerworm feeding corresponding host plant cotton, wheat and maize.Keywords: glutathione S-transferase; host plant; induced activity; Helicoverpa armigera