奶牛精子 RNA 提取及 RNA 质量鉴定的初步研究1.doc

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1、精品论文大集合奶牛精子 RNA 提取及 RNA 质量鉴定的初步研究1徐凯1，王宪1，曾有权1,2，陆阳清1，卢晟盛1，卢克焕11 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室, 广西大学动物繁殖研究所，南宁 (530004)2 西南大学荣昌校区，重庆荣昌 (402460)E-mail：xukai8322摘要： 本实验采用Trizol一步法和试剂盒提取奶牛精子的总RNA，通过OD260/280的测算， 初步测定所提取RNA的纯度，然后进行RT-PCR，通过对PRM1及看家基因-actin 的扩增及电 泳，检测总RNA的质量，皆得到质量可靠的奶牛精子总RNA。验证了Trizol一步法和试剂盒提 取奶牛精子

2、的总RNA方法的可行性，为进行奶牛精子中RNA的进一步研究提供了基础。 关键词：奶牛精子，RNA RT-PCR PRM1精子的发生对环境变化高度敏感5，精子的 RNA 分析能提供有效的分子记录来评定环 境的影响和精子基因的状态，有助于对动物生殖能力的研究。传统的观点认为，成熟精子内 致密包装的染色质是转录不活泼的1，成熟精子内几乎不存在 mRNA。Miller 等2，3在用精 子 mRNA 与睾丸 cDNA 文库杂交的研究分析中，提示了精子中 mRNA 的种类及转录功能的 复杂性，确认精子中包含大量的编码与不编码蛋白质的 RNA。 到目前为止，关于人精子 RNA 方面研究的报道很多2,3,4,

3、5,6,7,8,9，但有关奶牛精子 RNA 提取方面研究的报道较少。RNA 提取是分子生物学研究中的一项常规操作，使用市售 RNA 提取试剂盒，按照说明， 即可从正常组织、细胞中提取到较为理想的 RNA。但从精子中提取 RNA 和精子 RNA 的检 测及质量控制等工作，难度较大，国内报道较少，只见过毛向明等4检测人精子总 RNA 的报道。本实验对奶牛精子 RNA 的提取及检测等进行了初步探讨，采用 Trizol 一步法和试剂盒提取奶牛精子的总 RNA，并经检测得到了质量可靠的奶牛精子的总 RNA，为进一步深入 研究精子 RNA 在胚胎和生物体发育过程中的作用奠定基础。1. 试验材料1.1 样本

4、采集精液由广西大学奶牛场提供，采精后半小时内送到实验室。1.2 试剂及设备Trizol（Invitrogen）、Taq DNA Polymerase（宝生物工程大连有限公司）、AMV（宝生物 工程大连有限公司）、微量快速组织/细胞总 RNA 提取试剂盒（上海华尧核酸技术有限公司 W6221），其它试剂皆为国产分析纯；冷冻离心机（Eppendorf，5804R）、紫外分光光度计（Beckman，DU-800）、PCR 仪（GeneAmp，PCRsystem9700）、电泳仪（EC250-90）、凝胶 成像系统（Gene Genius，BIO Imaging system）。1.3 引物PRM1,

5、 上游 引物： 5 -AGACGAAGATGTCGCAGAC-3 ，下游 引物： 5 -CGTTGTGCTTAGCAGGCTC-3。-actin,上游引物：5-CAAGGACCTCTACGCCAACA-3， 下游引物：5-CTCGATCCAACCGACTGCT-3。引物由捷瑞生物工程（上海）有限公司合 成。1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20050593001）的资助。-5-2 试验方法2.1 精子总 RNA 的提取上游法收集精子：取 24mL 的新鲜奶牛精液，加入适量在 37，CO2 培养箱预处理的 受精液中，斜放试管 37水浴 30min 使精子上游，取适量的上层液体

6、用于后续的 RNA 提取。Trizol 一步法精子总 RNA 提取：取适量上游的奶牛精子于 DEPC 处理过的 EP 管中，4、5000rpm/min 离心 5min，去掉上清液,沉淀中加入 1mL4无钙镁的 PBS，混匀后，4、5000rpm/min 离心 5min，去上清液后再用 PBS 重新洗涤一次，留下沉淀。RNA 提取：加入1mLTrizol 到沉淀中，振荡、摇匀 2min，室温放置 10min；加入三氯甲烷 200400uL， 混匀，4、12000rpm/min 离心 10min，将上层清液转移至新的 DEPC 处理过的 EP 管中；再根据 上清液的多少加入 500uL800uL

7、异丙醇，混匀后于室温静置 10min ，然后在 4 、12000rpm/min 离心 10 min，弃去上清液；于沉淀中加入使用 DEPC 水临时配制的 500uL75% 的酒精洗涤，4、12000rpm/min 离心 5min，弃去上清液后重洗涤一次；让沉淀管在室温空 气中干燥后，加入 2050uLDEPC 处理过的水溶解沉淀。取样后可放于-80短期保存。试剂盒（W6221）提取 RNA：精子上游收集后，按试剂盒要求提取。2.2 总 RNA 纯度检测RNA 纯度测定：RNA 提取结束后，立即取样稀释（用 DEPC 处理的去离子水），用紫 外分光光度计测定 OD260/280。2.3 精子总

8、RNA 的 RT-PCR新提取的总 RNA 马上合成 cDNA 第一链, 扩增和检测 mRNA。RT-PCR 反应体系：RNA Free H2O 5.5uL，MgCl2 4uL，10RTbuffer 2uL，dNTP mixture4uL，Random Primer 1uL，RNA 2uL，AMV 1uL，RNase inhibitor 0.5uL，总 20uL；离心 30s后马上 RT-PCR；RT-PCR 条件设置：30，10 min，42，1h；99，5 min，5，5 min；4，pause。产物低温（4）保存备用。2.4 精子总 RNA 中 PRM1 mRNA 的检测PRM1 基因检

9、测体系：去离子水 18.8uL，PRM1 上游引物 0.5uL，PRM1 下游引物 0.5uL， PCR buffer 2.5uL，dNTP 2uL，cDNA 第一链产物 0.5uL，Taq 酶 0.2uL，总计 25uL；PCR 条 件为：95，4 min；95，30s；54，30s；72，30s；72，5 min；5，pause，40 个 循环。电泳：1%-1.5%琼脂糖胶，100v-120v，20-30 min；溴化乙锭染色 20 min；紫外凝 胶成像检测。2.5 精子总 RNA 中 -actin mRNA 的检测-actin 基因检测体系：去离子水 18.8uL，-actin 上游引

10、物 0.5uL，-actin 下游引物 0.5uL， PCR buffer 2.5uL，dNTP 2uL，cDNA 第一链产物 0.5uL，Taq 酶 0.2uL，总计 25uL；PCR 条 件为：95，4 min；95，30s；59，30s；72，30s；72，5 min；5，pause，35 个 循环。电泳：1%-1.5%琼脂糖胶，100v-120v，20-30 min；溴化乙锭染色 20 min；紫外凝胶 成像检测。3 结果3.1 Trizol 法与试剂盒提取总 RNA 的纯度采用 Trizol 一步法和试剂盒提取出奶牛精子总 RNA，用紫外分光光度计测 OD260/280值，都在 1.

11、4-1.6 左右，如表 3-1。表 3-1 Trizol 法与试剂盒提取总 RNA 的 OD 值Tab3-1 The OD of RNA extracted by Trizol and mini kit收集方法提取方法OD 260/280上游收集TrizoL1.5793试剂盒1.5782上游收集TrizoL1.5305试剂盒1.6413上游收集TrizoL1.5537试剂盒1.43843.2 RNA 质量鉴定PRM1，-actin 扩增产物皆能得到较理想的电泳条带，PRM1 所得条带约为 200bp, -actin所得条带约为 404bp，与目标条带大小相符，说明精子总 RNA 抽提质量可靠，

12、如图 3-2。图 3-2 Trizol 一步法和试剂盒提取奶牛精子的总 RNA 反转后扩增产物电泳图5 为 DNA Marker；1，2 分别为 Trizol 一步法和试剂盒提取奶牛精子的总 RNA 反转后 PRM-1 扩增产物；3，4 为分别为 Trizol 一步法和试剂盒提取奶牛精子的总 RNA 反转后 -actin 扩增产物。Fig3-2 The PCR products of PRM1and -actin5 DNA Marker； 1 products of PRM1 by Trizol; 2 products of PRM1by mini kit； 3 products of -ac

13、tin by Trizol4 products of -actin by mini kit4 讨论对 RNA 质量的判断，通常是以常规的电泳检测。然而，目前文献中很少见到精子的 RNA 电泳图。国内只有毛向明4等用微流路芯片高压凝胶电泳法检测精子 RNA 时得到精子总 RNA 的电泳图。另有文献报道，精子 RNA 中不含 28S 和 18S rRNA，这可以作为一个特征 用来衡量精子 RNA 样本的纯净程度的标志12。因此，本实验通过对 PRM-1 及看家基因 -actin 的扩增及电泳，来检测总 RNA 的质量，而对于精子 RNA 质量的判断是否能以常规 的电泳来检测，还需进一步研究。通常，

14、Trizol 一步法和试剂盒提取组织或正常细胞的 RNA，用水溶解时其 OD260/280 在 1.6-1.810，用 TE 缓冲液（Tris+EDTA）溶解时大于 1.8。在本实验中 Trizol 一步法和试 剂盒提取奶牛精子的总 RNA，精子总数约为 106-107 个，OD260/280 数值多在 1.4-1.6。其 OD 偏低的原因应与 RNA 含量太少，及使用较多数量精子进行提取，导致 RNA 可能有蛋白 质等污染有关。人精子 RNA 的研究表明，在成熟人精子中含有 PRM1、PRM2、TNP2 等 mRNA，分布 于精子整个头部，其含量与睾丸中类似6。Aoki 等报道，PRM1 的

15、 mRNA 存在于所有哺乳 动物精子中7。PRM1 和 PRM2 基因的编码产物鱼精蛋，为分子量低的碱性蛋白质，在精子 成熟后期起作用，与精子染色质的浓缩有关11。因此本实验选择 PRM1 及在看家基因 -actin 为参照进行研究。虽然精子 RNA 提取纯度不太理想，但都扩增出 PRM1，-actin 的产物， 说明提取质量是可靠的，Trizol 一步法和试剂盒提取奶牛精子的总 RNA 是可以使用的，为 进一步进行精子中 RNA 的研究，提供了参考依据。参考文献1 Kierszenbaum AL, Tres LL. Structural and Transcriptional Feature

16、s of the Mouse. Spermatid GenomeJ. J Cell. Bi0l. 1975, 65(2): 258-270.2 Miller D, Tang P Z, Skinner C, et al. Differential RNA fingerprinting as a tool in the analysis of spermatozoa gene expressionJ. Hum.Reprod. 1994, 9, 864-869.3 Miller D, Briggs D, Snowden H, et a1. A complex population of RNAs e

17、xists in human ejaculate spermatozoa:implications for understanding molecular aspects of spermiogenesisJ. Gene. 1999, 237(2): 385-392.4 毛向明, 马文丽, 冯春琼等. 应用微流路芯片高压凝胶电泳检测精子RNAJ. 解剖学报, 2005, 36(3):326-329.5 Brinkworth M. Paternal transmission of genetic damage: findings in animals and in humans J. Int J

18、 Androl.2000, 23(3):123-135.6 Wykes S M, Visscher D W, Krawetz S A. Haploid transcripts persist in mature human spermatozoaJ. MolHum Reprod. l997, 3(1): l5-l9.7 Aoki V W, Carrell D T. Human protamines and the developing spermatid: their structure, function, expression and relationship with male infe

19、rtilityJ. Asian. J Androl. 2003, 5(3): 315-324.8 Ostermeier G C, Dix D J Miller D, Khatri P, et a1. Spermatozoal RNA profiles of normal fertile menJ.Lancet.2002, 360: 772-777.9 Ostermeier G C, Miller D, Huntriss J D, et al. Delivering spermatozoan RNA to the oocyteJ. Nature. 2004,429, 154.10 郑晓飞. RN

20、A 实验技术手册M. 科学出版社, 2004.8.11 Lee C H, Cho Y H. Aspects of mammalian spermatogenesis: electrophoretical analysis of protamines in mammalian speciesJ. Mol.Cells.1999, 9, 556-559.12 Miller D, Briggs D, Snowden H, et al. A complex population of RNAs exists in man ejaculate spermatozoa:implications for un

21、derstanding molecular aspects ofrmiogenesisJ. Gene. 1999, 237, 385-392.The preliminary study on extraction and quantity analysis ofRNA in Cattle SpermatozoaXu Kai1, Wang Xian1, Zeng Youquan1,2, Lu Yangqing1, Lu chengsheng1, LuKehuan11 Animal Reproduction Institute, Guangxi Key Laboratory of Subtropi

22、cal BioresourceConservation and Utilization, Guangxi University, Nanning, PRC (530004)2 Southwest University, Rongchang, PRC (402460)AbstractIn this research, total Cattle spermatozoa RNA was extracted by Trizol and mini kit(W6221).Concentration of total RNA recovered was evaluated by OD260/280. Tra

23、nscript of PRM1 and -actinin total RNA were subsequently detected and analysed by RT-PCR and PCR to confirm RNAs quality.The results indicates that the total RNA from cattle spermatozoa by Trizol and mini ki（tused for further research .Keywords: cattle spermatozoa, RNA, RT-PCR, PRM1W6221）can be作者简介:徐凯（1983-），男，山东省东营市人，在读硕士研究生。研究方向：生物技术与 分子生物学。