豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn).doc
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1、精品论文豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)作图群体遗传分析1魏臻武 1,2, 盖钧镒 1,张丽芳 3,杨占花 3,雷艳芳 31 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京(210095)2 扬州大学动物科学与技术学院,扬州(225009)3 甘肃农业大学草业学院,兰州(730070)E-mail: sri摘要:通过形态特征和 SSR 标记,对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)种质资源进行了鉴定和筛选,选配两个差异较大的蒺藜苜蓿亲本 W5160 和 Jemalong 进行杂交,获得杂 交组合 W5160Jemal
2、ong,进而构建了蒺藜苜蓿的 F2 群体,并应用植物数量性状主基因 多基因分离分析法对该群体的相关性状进行了多个世代的联合分析。结果表明,19 个不同 来源的一年生苜蓿遗传多样性丰富。Jemalong 、DZA 、Caliph 等种质间有较大差异。 W5160Jemalong 组合一级侧枝长度以及种子产量的遗传模式为两对加性-显性-上位性主基 因+加性-显性多基因模型。该组合分离世代 F2 群体侧枝长度、百荚重、种子产量等农艺性 状的遗传以主基因为主,多基因遗传率相对较低,在育种中应重在主基因的利用,兼顾多基因的积累。关键词:蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.);
3、SSR 标记;作图群体;遗传分析蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)是继拟南芥和水稻后第 3 个进行全基因组测序 的植物。作为豆科模式植物,蒺藜苜蓿遗传图谱已经成为豆科作物比较基因组学研究和重要 农艺性状基因分离定位的重要工具。蒺藜苜蓿与大豆等大多数豆科作物具有遗传上的相似 性,同时与紫花苜蓿亲缘关系很近,与苜蓿基因组具有很高的同源性1,2。因而从蒺藜苜蓿 获得的信息可以用于其它豆科植物,蒺藜苜蓿比较基因组学的研究对于挖掘我国豆科植物遗 传资源,促进豆类作物和牧草的遗传育种有重要意义。Thoquet 等 (2002) 3选择在形态上有显著差异的 Jemalong
4、和 DZA 两个材料作为亲本建 立 F2 群体,构建了第一张蒺藜苜蓿遗传图谱25。欧洲蒺藜苜蓿基因组计划(2003)公布了基 于 Jemalong 和 DZA315 的 RILs 群体的遗传图谱4。大多数重要农艺性状,如产量、品质、 熟期等均表现数量性状的遗传特点,即受许多数量基因座位(Quantitative Trait Loci,QTLs) 和环境因子的共同作用(Michelmore 等,1988)。Elston 和 Stewart(1973)提出“一个主基因 和多基因”的遗传模型。Eilind 和 Cahaner(1986,1990)提出了一个用于植物遗传数据分析 的单基因-多基因遗传模
5、型5,6。盖钧镒等(2003)5,提出了主基因和多基因混合遗传模型, 它以分离世代次数分布提供的信息为基础,给出了数量性状基因体系及其效应的最佳估计。 目前遗传分离分析方法在牧草中的应用未见相关报道。本研究运用盖钧镒等发展的植物数量 性状混合遗传模型主基因+多基因多世代联合的遗传分离分析方法,对构建的蒺藜苜蓿 F2 作图群体进行遗传分析。1本课题得到南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室开放课题“豆科模式植物蒺藜苜蓿与豆科作 物的比较基因组学研究”,中国博士后科学基金和江苏省博士后基金项目的资助。- 9 -1. 材料与方法11 试验材料2005 年 2 月 20 日在江苏南京国家大豆改良
6、中心江浦试验站种植 19 份一年生苜蓿种质, 按以下方法进行田间调查记载。叶形:菱形(叶长/叶宽1.0),倒卵形(叶长/叶宽=1.62.0)。 叶斑:叶片有无褐色斑点,大小及位置。 花期:种植至开花的日数。生育期:种植至成熟的日数。 荚果形状:荚果黑色弯曲成肾形、螺旋状荚果、蜗牛状荚果。 一级侧枝长:从植株基部分出的枝条长度。 二级侧枝长:一级侧枝上的分枝长度。 地上生物量:收获时的植株及荚果重量。百荚重:随机数出 100 个荚果称重。2006 年 7 月在国家大都改良中心江浦试验站以行距 30cm,穴距 30cm,每行 7 穴且单粒穴 播的播种方式种植 F2 群体 121 个单株。12DNA
7、 的提取在田间小区中每个重复随机选择 20 片幼叶,取回实验室立即用液氮冷冻研磨处理。苜 蓿叶片总 DNA 的提取采用 CTAB 法7。13SSR 的 PCR 扩增和检测利用优化了的 SSR 反应体系8-9,对一年生苜蓿种质和蒺藜苜蓿杂交组合进行 SSR 分析。 PCR 反应程序为:94预变性 3min,95变性 1min,52退火 1.5min,72延伸 60s,共 循环 35 次,最后 72保温 8min,4保存。反应体系为 10 l。PCR 反应在 PE-9600 热循环 仪中进行。扩增产物用 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。14数据分析对 SSR 引物在 19 个一年生苜蓿种质中扩增的多态
8、性条带,有带的量化为 1,无带的量 化为 0。采用 Nei 氏距离(Neis distance)计算成对品种的遗传距离,采用类平均法(UPGMA, Unweighted Pair Group Method Arithmetic averages)对遗传距离矩阵进行聚类分析。所有数 据统计均利用 NTSYS-pc(Version 1.8)软件完成。运用植 物数 量性状 混合 遗传模 型主 基因 + 多基 因多世 代联 合分析 方法 5 , 6 ,对 P5160Jemalong 组合 4 个世代的侧枝长度,分枝数进行联合分析,并估算主基因和多基因 遗传参数。利用 Excel 对数据作次数分布表,然
9、后利用植物数量性状的主基因多基因混合 模型软件(章元明),根据次数分布的信息,对 A、B、C、D、E 共 5 类遗传模型求出极大 似然函数值。由模型的极大似然函数值计算出 AIC 值,AIC 值最小的模型为相对最佳模型, 模型间 AIC 值差异不大时可能有几个供选的相对最佳模型。然后根据似然比函数(LRT,检 验模型间的差异性),以及一组适合性检验(均匀检验 U12、U22、U32, Smirnov 检验, Kolmogorov 检验 Dn,用来检验期望分布与观测分布间的一致性),从而选择最佳遗传模型, 并根据模型估计主基因和多基因的效应值及其方差等遗传参数。2结果与分析21 一年生苜蓿种质资
10、源的搜集和鉴定搜集整理了以蒺藜苜蓿为主的 19 个一年生苜蓿种质,分别来自法国、澳大利亚和中国。 其中蒺藜苜蓿 DZA、J51 等 6 份材料来自原产地法国,SA37 和 SA36 来自澳大利亚。一年 生苜蓿种质名称和来源见表 1。田间试验结果表明,不同一年生苜蓿种质无论在种内还是种 间,在形态上都存在较大差异。蒺藜苜蓿 Jemalong、DZA、Caliph 和选系 W5160 等种质间 有较大差异。种质编号表 1 一年生苜蓿种质来源与特征Tab. 1 The Traits and the Origin of Annual Medicago种名拉丁名特征生育期(d)种质来No.No. ofg
11、ermplasmSpecificname天蓝苜LatinnameTraitsGrowthperiod源Origin1MLM. lupulin 小叶倒卵形,荚果黑色弯曲成肾形。125甘肃 蓿小叶菱形,无叶斑。荚果桶状具平2GN143J514FE625DZA6MS567MS548FE619GN1510SA37蒺藜苜蓿蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿蜗牛苜 蓿 蜗牛苜 蓿蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿M.truncat ulaM. truncatul aM. truncatul aM. truncatul aM. scutellataM. scutellataM. truncatul aM. trun
12、catul aM. truncatula行刺,刺小、顺时针螺旋,紧密,4 回。种子肾形。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果桶状 具刺、逆时针螺旋,紧密,6 回。种 子肾形。小叶菱形,有叶斑。荚果桶状具有 硬刺、逆时针螺旋,紧密,6 回。小叶菱形,无叶斑。荚果桶状,顺 时针螺旋,紧密,4 回,具平行刺, 刺小。种子肾形。 小叶倒卵形,无叶斑。蜗牛状荚果、 逆时针螺旋。 小叶倒卵形,无叶斑。蜗牛状荚果、 逆时针螺旋。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋,6 回,紧密,具硬刺。种子 肾形。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋,6 回,紧密,具刺。种子肾 形。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋
13、,6 回,紧密,具刺。种子肾 形。125南京115法国110法国120法国104甘肃104甘肃120法国120南京 澳大利115亚11SA36蒺藜苜M.truncat ula小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时115法国蓿针螺旋,6 回,紧密,具刺。种子肾形。12Caliph13DZA5114W513615TM16GN1017W514518W516019W5003蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿蜗牛苜 蓿蒺藜苜 蓿蒺藜苜 蓿M. truncatul aM. truncatul aM. truncatul aM. truncatul aM. truncatul aM. scutell
14、ataM. truncatul aM. truncatula小叶菱形,无叶斑。荚果顺时针螺 旋,紧密,4 回,刺小。种子肾形。 植株较小。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋,6 回,紧密,具刺。种子肾 形。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋,6 回,紧密,具刺。种子肾 形。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋,6 回,紧密,具刺,荚果坚 硬。种子肾形。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋,6 回,紧密,具刺。种子肾 形。 小叶倒卵形,无叶斑。蜗牛状荚果、 逆时针螺旋。 小叶菱形,有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋,6 回,紧密,具刺。种子肾 形。侧枝较长、种子产量高。 小叶菱形,
15、有褐色叶斑。荚果逆时 针螺旋,6 回,紧密,具刺。种子肾 形。94青海120法国110南京115法国125甘肃104甘肃120甘肃120甘肃22一年生苜蓿遗传多样性的 SSR 分析图 1 基于 SSR 标记的一年生苜蓿种质聚类图Fig.1 Cluster dendrogram of annual medicago germplasm based on SSR markers用 SSR 标记在分子水平上对一年生苜蓿遗传多样性进行评价。尝试利用不同物种间通用 SSR 引物,本实验从已有的 800 多对大豆、苜蓿和蒺藜苜蓿 SSR 引物中,筛选出了 32 对多态性高的 SSR 引物,用于一年生苜蓿种
16、质鉴定和遗传多样性评价。利用优化了的 SSR 体系对 19 个一年生苜蓿进行 SSR 扩增,结果显示,一年生苜蓿的 SSR 反应扩增强,条带清 晰且特异性好,较稳定。19 份一年生苜蓿种质在分子水平上表现出明显的多态性差异,SSR 标记可以有效地区别一年生苜蓿种质种间和种内的差异。利用 SSR 扩增结果,采用 UPGMA 法对 19 个一年生苜蓿种质进行聚类分析,聚类结果见图 1。SSR 标记聚类的结果可以很好 地说明不同来源一年生苜蓿种质资源的遗传差异和相似性,在相似系数 0.62 处可区分一年 生苜蓿的种间差异,在相似系数 0.71 处可区分一年生苜蓿的种内差异。聚类结果表明,蜗 牛苜蓿与
17、蒺藜苜蓿的亲缘关系较近,而与天蓝苜蓿的亲缘关系较远。不同来源的蒺藜苜蓿种 质遗传差异显著,品种 Jemalong、DZA、Caliph 和选系 W5160 等种质间有较大差异。聚类 结果也为蒺藜苜蓿遗传作图群体的亲本选配提供了依据。SSR 标记聚类的结果与农艺性状具 有很高的相似性,且分子标记鉴定种质资源时不受生长环境影响,避免了农艺性状鉴定中人 为因素带来的误差。因此 SSR 标记能够更加准确的揭示材料间的遗传差异,为种质资源的 鉴定提供保障。23蒺藜苜蓿遗传作图群体的构建确定作图群体的亲本是成功构建作图群体的关键,依据亲本选配的原则,筛选农艺性状 差异较大的材料做为亲本。本试验筛选出了在形
18、态和分子水平存在较大差异的亲本材料 DZA、Caliph、Jemalong 和选系 W5160 等材料。经过对生育期、种子产量、叶形、叶斑、 荚果螺旋、株型、株高等性状的考察,确定多个组配。P5160Jemalong 是多个组配中繁育 进程较快的组合。同时,利用 SSR 标记对亲本的多态性进行验证。SSR 标记可以在 F1 代进 行早期鉴定,有快速、准确,操作简便的优点。SSR 分子标记鉴定结果表明,P5160Jemalong 组合 F1 既具有母本特征条带又具有父本特征条带,为杂交种,同时含有父母本的基因型。 在对其后的 F2 分离群体的观测也证明该杂交种为真杂交种。从 F1 共获得 F2
19、群体 121 个家 系。24P5160Jemalong 作图群体的遗传分析运用植物数量性状混合遗传模型主基因 + 多基因多世代联合分析方法,对 P5160Jemalong 组合 P1、P2、F1、F2 等 4 个世代的一级侧枝长度、地上生物量、百荚重、地上生物量(g)above-ground biomass201818161614141212101088664422次数(No.of lines)0次数(No.of lines)(cm) 030212518次数(No.of lines)20 1515 129次数(No.of lines)10百荚重65 100-pod weight30 0种子产量
20、(g)seed yield图 2 W5160P5160 作图群体一级侧枝长度、地上生物量、百荚重及种子产量的次数分布及拟合混合分布Fig.2 Frequency distribution and fitted mixed distribution for branch,biomass,100-pod weight and seed yield种子产量等进行联合分析,并估算主基因和多基因遗传参数。根据次数分布,由模型的极大似然函数值计算出 AIC 值,AIC 值最小的模型为相对最佳模型。然后根据似然比函数(LRT,检验模型间的差异性)以及一组适合性检验(均匀检验 U12、U22、U32, Smi
21、rnov 检验,Kolmogorov 检验 Dn,用来检验期望分布与观测分布间的一致性),从而选择最佳遗 传模型,并根据模型估计主基因和多基因的效应值及其方差等遗传参数一级侧枝长度、地上 生物量、百荚重、种子产量等性状在 P5160Jemalong 组合 F2 群体中的次数分布见图 2。 W5160P5160 F2 群体的一级侧枝长度大部分介于 14.3cm26.3cm 之间,其平均值为25.774cm1.167,其长度低于高值亲本 W5160 平均值 52.518cm,高于低值亲本 Jemalong 平 均值为 19.235。P5160Jemalong F2 群体的地上生物量大部分介于 32
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