人卫8版-DNA重组及重组DNA技术.ppt

《人卫8版-DNA重组及重组DNA技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人卫8版-DNA重组及重组DNA技术.ppt（95页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、生物化学与分子生物学,DNA重组和重组DNA技术DNA Recombination and Recombinant DNA technology,第二十一章,DNA重组（DNA recombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。,第一节自然界DNA重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature,DNA重组,同源重组(hom

2、ologous recombination)位点特异的重组(site-specific recombination)转座重组(transposition recombination)接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction),发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holli

3、day模型,一、同源重组是最基本的DNA重组方式,Holliday模型的4个关键步骤：,两个同源染色体DNA排列整齐；,一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；,通过分支移动产生异源双链DNA；,Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、Rec

4、BCD复合物和RuvC蛋白。RecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。RecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA复合物。RuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。,Holliday中间体,5,片段重组体,拼接重组体,二、位点特异重组是发生在特异位点间的DNA整合,位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。,噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点

5、发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)。,（一）噬菌体DNA的整合,（二）细菌的特异位点重组,沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。,hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。,沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变,（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因

6、族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。,轻链的基因片段：,重链的基因片段：,重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。,免疫球蛋白基因重排过程,三、转座重组可使基因移位,由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。,大多数基因在基因组内的位置是

7、固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。,插入序列(insertion sequences,IS)组成：,（一）插入序列转座,二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)序列,特有的正向重复序列,一个转座酶（transposase)编码基因,插入序列发生转座的形式：,保守性转座(conservative transposition),复制性转座(duplicative transposition),插入序列的复制性转座,转座子(transposons)可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。,（二）转座子转座,转座子组

8、成：,反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因,细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L,由转座子介导的转座,四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组,（一）接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,可接合质粒如 F 因子(F factor),细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。,质粒,（二）转化作用,通

9、过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。,噬菌体的生活史,溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径(lysogenic pathway),第二节 重组DNA技术,Recombinant DNA Technology,重组DNA技术的发展史,1865年 的豌豆杂交试验。1944年 的

10、肺炎球菌转化实验。1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,重组DNA技术相关概念,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone)（即DNA 克隆）细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,其主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能

11、自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。,重组DNA技术，又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因工程（genetic engineering）技术,目的：分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,一、重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),限

12、制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列,并裂解磷酸二酯键。,+,Bam H,定义：,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,、（基因工程技术中常用型）,分类：,作用：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,Bam

13、 H,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同裂酶：,限制性内切核酸酶,二、重组DNA技术中常用的载体,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,载体按功能分为 克隆载体(cloning vector)表达载体(expression vector),克隆载体(clon

14、ing vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体(expression vector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,（一）克隆载体,至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；至少有一个选择标志（selection marker）：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等。有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，可供外源基因插入时

15、选择，叫多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）。,1.克隆载体应具备的基本特点,（1）质粒(plasmid),特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,2.常用的克隆载体,pUC18质粒载体图谱,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,（2）噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列 pUC系列,柯斯质粒（cosmid）载体（又称黏粒载体）酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体

16、(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,（3）其他克隆载体,（二）表达载体,表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。根据宿主细胞分为：原核表达载体真核表达载体,1.原核表达载体,原核表达载体的基本组成,R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列,2.真核表达载体,真核表达载体的基本组成,OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。,第三节重组DNA技术基本原理和操作步骤,基本原理,以 质 粒 为 载

17、 体 的DNA 克 隆 过 程,（一）目的基因的分离获取分,化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA(见第20章)PCR法(见第20章)其他方法(见第20章),化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,从cDNA文库获取目的基因,（二）载体的选择与构

18、建选,目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。,目的：获得某一目的基因或DNA片段 获得目的DNA片段所编码的蛋白质,不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞,（三）目的DNA与载体连接接,方式：（1）单一相同黏端连接（2）不同黏端连接（3）通过其他措施产生黏端进行连接,黏端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,单一相同黏端连接,不同黏端连接（定向克隆）,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头(linker)连接,通过其他措施产生黏端进行连接,人工接头及其应用,在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在D

19、NA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,同聚物加尾连接,PCR法,针对目的DNA的5-和3-端，设计一对特异引物，在每条引物的5-端分别加上不同的RE位点，然后以目的DNA为模板，经PCR 扩增便可得到带有引物序列的目的DNA，再用相应RE切割PCR产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。,平端连接,限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,适用于：,3.粘-平末端连接,黏-平末端连接是指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。属于定向克隆,受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

20、,导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA转入受体细胞转,1.借助载体上的遗传标志进行筛选(1)利用抗生素抗性标志筛选(2)利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选(3)利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选,（五）重组体的筛选与鉴定筛,2.序列特异性筛选(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸杂交法(4)DNA测序法 3.亲和筛选法,插入失活筛选带有重组载体的克隆,互补筛选（蓝-白筛选）,菌落或噬斑原位杂交筛选重组体,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的

21、建立：表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)；很难表达大量可溶性蛋白。,1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用),优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系（

22、酵母、昆虫、乳类动物细胞）,第三节 重组DNA技术在医学中的应用,Application of Recombinant DNA Technology in Medicine,一、重组DNA技术广泛应用于生物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。,美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。,重组DNA医药产品,二、重组DNA技术还应用于医学的其他诸多方面,疾病相关基因的发现与鉴定 转基因和基因打靶 加速了人类基因组计划的完成 疾病的基因诊断和基因治疗,