[精品论文]EECP 蛋白表达在乳腺癌中的初步研究.doc

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1、精品论文EECP 蛋白表达在乳腺癌中的初步研究王宇1,2，严华梅1，王艳萍1，王竹1，郑鸿1（1. 四川大学华西医院肿瘤分子诊断研究室，成都 610041；52. 生物治疗国家重点实验室，成都 610041）摘要：目的：研究 EECP 蛋白在乳腺癌患者组织和血浆标本中的表达情况。方法：采用免疫 组化方法检测 15 例乳腺癌石蜡组织切片中的 EECP 蛋白表达水平。ELISA 法检测 130 例乳腺癌患者，对照组为 71 例体检健康或乳腺良性增生女性的血浆中 EECP 蛋白的浓度。结果：10对照组全部 15 例癌旁正常组织结果为阴性。15 例乳腺癌组织中，12 例肿瘤细胞胞浆染色强 阳性，呈弥漫

2、性分布；1 例结果为阴性；2 例结果不确定，EECP 蛋白在乳腺癌组织中表达显著增加。乳腺癌患者血浆中 EECP 蛋白浓度为 13.381.37 ng/ml，对照组为 3.70.48 ng/ml。EECP 蛋白在乳腺癌血浆中显著升高（P0.01）。结论：EECP 蛋白可能是一个乳腺癌相关基因，及其肿瘤标志物。15关键词：乳腺癌；EECP；ELISAThe study of expression of EECP in breast cancerWANG Yu1,2, YAN Huamei1, WANG Yanping1, WANG Zhu1, Zheng Hong120(1. Laborator

3、y of molecular diagnosis of cancer,west china hospital,Si Chuan University, ChengDu 610041;2. State key laboratory of the biotherapy and cancer center, west china hospital,Si ChuanUniversity, Cheng Du 610041)Abstract: Objectives: The study was aimed to investigate the EECP expression in tissue and p

4、lasm25of breast cancer patients. Method: EECP protein in 15 tissue slices were detected by IHC assay.EECP protein in plasma of 71 normal /benign disease females and 130 breast cancer patients were detected by ELISA assay. Result: The result of all cases of control from adjacent tissue was negative.

5、Strong,diffuse EECP staining was detected in 12 cases of breast cancer tissue, 1 case was negative,2 cases were uncertain. Stronger expression of EECP protein was observed in breast30cancer specimens compared with the adjacent normal tissue. EECP protein conentration in thebreast cancer patinet was

6、13.381.37 ng/ml, while that in controls was 3.70.48 ng/ml. There was a statistical significance increased（P0.01）. Conclusion: EECP may be a breast cancer relatedgene and tumor marker.Key words: breast cancer; EECP; ELISA350引言乳腺癌是女性主要的恶性肿瘤之一，发病率在世界范围内不断上升。据报道，2007年美国乳腺癌新发病例数，位居女性新发肿瘤的首位和因肿瘤死亡的第2位1。我国

7、虽属女性乳腺癌的低发国，但近年来乳腺癌的发病率明显增高，居女性40恶性肿瘤的第二位，发病年龄也由中老年妇女向青年女性扩展，沪、京、沿海等发达地区成为我国乳腺癌的高发地区2, 3。当前，乳腺癌诊断仍主要依靠自我检 查、临床体检及影像学检查，如钼靶摄片、B超等，这对于相当一部分肿块较小基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20090181110070） 作者简介：王宇（1980），男，助理实验师，肿瘤分子生物学 通信联系人：郑鸿（1965），男，教授，乳腺癌的基础与临床. E-mail: hongzheng11- 5 -甚至不能扪及肿块的患者，以及对大部分乳腺组织较致密、脂肪组织不多而

8、不适于钼靶诊断的东方女性而言，仅仅依靠上述传统手段进行早期诊断，存在很大的45困难。虽然近年来乳管镜和乳腺导管灌洗液细胞学检查的应用，为大导管内无肿 块、无钙化的乳腺导管原位癌的诊断提供了一条新途径，但其检查途径的侵入性 及对技术设备条件的较高要求，给其推广应用带来了阻力4。在乳腺癌术后疗效 评价、预后估计和随访方面，也主要也依赖于上述经典手段，但效果难以令人满 意。乳腺癌的发生是基因、环境复杂交互作用的结果，但是其确切的发病机制仍50不清楚。 通过对乳腺癌相关基因及表达蛋白的深入研究，能够更加了解乳腺癌细胞的生物学行为，揭示其发病机制，有助于发明新的乳腺癌诊断、治疗、预后监测等 方法5。我们

9、在前期研究中，报道发现了乳腺癌相关基因EECP。本次将继续研究 EECP蛋白在临床乳腺癌患者标本中的表达情况。551 材料与方法1.1 对象 我院 130 例乳腺癌患者，均由病理诊断确诊，平均年龄 49.41 岁。对照组为体检健康或乳腺良性增生女性，共 71 例，平均年龄 40.06 岁。均征得参 与者的知情同意。1.2 试剂和仪器 羊抗兔 IgG 抗体(中杉金桥)，DAB 显色液（博士德），TMB 显色60液（P0209 碧云天），兔抗人 EECP 蛋白多克隆抗体，小鼠抗人 EECP 蛋白单克隆 抗体为本室自制。酶标仪（Therm,USA），恒温培养箱（ZGB-2080）。1.3 标本采集

10、术前抽取患者静脉血 4ml，置于未加抗凝剂管中，室温放置 30min，4下 3000g 离心 15min，取上清液存于-80冰箱保存，待用。取乳腺癌和癌旁 正常组织标本，固定于 4%甲醛 24h，经常规脱水，石蜡包埋，切片。651.4 免疫组化法检测组织中 EECP 蛋白表达 组织切片厚度 5um，一抗为本室自制 的兔抗人 EECP 蛋白多克隆抗体，浓度 1:500，37孵育 2h。二抗为辣根过氧化 物酶标记的羊抗兔 IgG 抗体，37孵育 30min。DAB 显色，苏木精复染, 显微镜 下观察结果。1.5 ELISA 检测血浆中 EECP 蛋白含量 筛选配对的小鼠抗人 EECP 蛋白单克隆抗

11、70体，采用双抗夹心 ELISA 法检测血浆中 EECP 蛋白含量。将抗体 4A10D7、2A7B2混合，包被酶标板 4，24h。血浆标本按 1:4 稀释，将其加入包被一抗的 96 孔酶标板，37孵育 2h；二抗 HRP 标记的 4F7D3 37孵育 1.5h；TMB 显色，使用酶标仪测定 450nm 处的 OD 值，根据标准曲线计算 EECP 蛋白含量。1.6 统计学处理 所有数据采用 SPSS16.0 进行统计学处理，用 SE 表示。t 检75验分析数据。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 乳腺组织中 EECP 蛋白表达 采用免疫组化法，EECP 阳性表达细胞染色为胞浆 棕色着

12、色，阴性细胞不着色。对照组全部 15 例癌旁正常组织结果为阴性（图 1A、80B）。15 例乳腺癌组织中，12 例肿瘤细胞胞浆染色强阳性，呈弥漫性分布(图 1C、 D)；1 例结果为阴性；2 例结果不确定。这表明 EECP 蛋白在乳腺癌组织中表达显 著增加。1.AC8590BD95100105图 1.乳腺组织中 EECP 蛋白的表达。采用免疫组化法，癌旁正常组织细胞中 EECP 蛋白染色（A,B），400， 乳腺癌肿瘤组织中 EECP 蛋白染色（C,D），400。Figure1.Expression of EECP in breast tissues by IHC. EECP in corre

13、sponding adjacent normal breast tissues(A,B) ,400, in breast cancer tissues(C,D) , 400.2.2 血浆中 EECP 蛋白含量 对照组健康或乳腺良性增生女性血浆中 EECP 蛋白浓 度为 3.70.48 ng/ml，乳腺癌患者血浆中 EECP 蛋白浓度为 13.381.37 ng/ml。EECP 蛋白在乳腺癌患者血浆中的浓度显著升高（P0.01）（图 2）。2.EECP血浆 中 的 含量 （ng/ml)2015 *1101050对照组(n=71) 乳腺癌(n=130)115图 2.EECP 蛋白在血浆中的含量。*

14、 P0.01Figure 2.EECP protein conentration in the plasm by ELISA. * P0.011201251301353.讨论乳腺癌是威胁女性健康最严重的疾病之一，发病率和死亡率都很高。近年来， 在乳腺癌诊断、治疗、术后疗效评价方面，发现了一些标志物。如，对 MUC1 基因的相关蛋白质标志物 CA15-3 和 CA27-29 的检测，可作为检测乳腺癌术后有 无复发及治疗效果的一种方法，但是它们特异性和敏感性尚不能达到人们的期望 6。“Her-2/neu”基因是侵袭性乳腺癌的标志物7。它在乳腺癌细胞中过度表达， 提示肿瘤具有侵袭性，术后容易复发，对

15、 Tamoxien 治疗效果差,对非蒽环类为基 础药物的化疗方案不敏感。针对 Her-2 基因扩增的病人，已经研发出了免疫治疗 药物 Herceptin。可是只有大约 25-30%的乳腺癌患者才有该基因的扩增，这就极 大的限制了适用人群8。因此寻找新的、更特异，更敏感的乳腺癌相关基因，在 全球范围内具有重要的科学意义、社会意义和重大的经济效益。我们发现的EECP基因与国外报道的ZG16B基因（PAUF；HRPE773；Gene ID124220）非常相似。ZG16B定位于染色体16p13.3，mRNA含有846个碱基，编码的 蛋白质含有208个氨基酸，分子量为25KD。EECP与ZG16B相比

16、：EECP定位于染色体12.3，两者在染色体的位置有细微差异，Blast的序列比对表明它们的mRNA序列 有极高的同源性（S1400,E0），特别是两者的编码序列完全一致，编码的蛋 白质氨基酸序列相同。我们推测EECP与ZG16B可能是同一个基因。2009年，Kim SA, et al使用基因芯片研究胰腺癌相关基因，发现与ZG16B同源的基因PAUF9，mRNA含有721个碱基，编码的分泌性蛋白PAUF含有196个氨基140145150酸，分子量约为25KD。PAUF与EECP/ZG16B相比，前者的5端序列明显较短，少编码12个氨基酸。PAUF在正常细胞系中不表达，在正常胰腺组织中表达很低；

17、但 是在胰腺癌细胞系，胰腺癌组织及胰岛细胞中显著高表达。PAUF高表达，通过激 活ERK、JNK和AKT信号通路，以及上调趋化因子受体CRCX4，从而提高胰腺癌细胞 生长、侵袭和转移的能力10, 11。EECP与PAUF同源性较高，都是从外分泌腺的肿瘤组织中发现，本次研究也表 明EECP蛋白在乳腺癌患者的组织和血浆标本中显著高表达。我们推测：EECP可能 是一个乳腺癌相关基因，并且可能是一个潜在的肿瘤血清标志物。在以后的研究 中，我们将继续研究EECP蛋白在乳腺癌中的生物学功能和作用机制，及与临床指 标的关系，探索其在乳腺癌治疗、预后监测等方面的应用。参考文献 (References)1551

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