[精品论文]Sonic Hedgehog 信号通路在脉络膜视网膜.doc
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1、精品论文Sonic Hedgehog 信号通路在脉络膜-视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和血管管腔形成中 的作用5何花,李贵刚(华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科,武汉 430030) 摘要:【目的】目前研究表明 Sonic hedgehog (Shh)信号通路参与组织缺血缺氧下血管新生 的病理过程,而缺血缺氧在脉络膜新生血管(CNV)中起着重要作用。本实验研究旨在探 讨 Shh 信号通路在缺氧状态下脉络膜-视网膜血管内皮细胞增殖、迁移以及血管管腔形成中10的作用及机制。【方法】用 200 mol/L CoCl2 造成体外细胞化学性缺氧,体外培养缺氧状 态下的脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6A
2、 细胞)来研究缺氧条件下 Shh-Ptch-Gli1 信号通路及相 关信号通路中 PTCH1、GLI1、DLL4, HES1, HIF-1 等基因的时程表达规律。利用 real-time PCR 和蛋白印迹技术研究 Shh 信号通路的激动剂和阻滞剂对相关调控基因(PTCH1、GLI1、DLL4) mRNA 和蛋白表达水平的影响,并进一步研究了 Shh 信号通路的激动剂和阻滞剂对 RF/6A15细胞参与新生血管形成的生物学功能(包括细胞增殖,移行以及管腔形成)的影响。【结果】 缺氧导致体外 RF/6A 细胞中 PTCH1、GLI1、DLL4、HES1 和 HIF-1 的表达上调。Shh 信号通路
3、激动剂 rShh 能促进相关调控基因(PTCH1、GLI1、DLL4)mRNA 和蛋白的表达,并 能促进缺氧下 RF/6A 细胞增殖、迁移和血管管腔形成。相反,Shh 信号通路阻滞剂 cyclopamine 则能下调调控基因(PTCH1、GLI1、DLL4)mRNA 和蛋白的表达,并能抑制20缺氧下 RF/6A 细胞增殖、迁移和血管管腔形成。两者作用具有显著性差异(P0.05)。【结论】 Shh 信号通路可通过调节交互的 HIF-1-VEGF-DLL4 信号通路来参与 CNV 发生发展。Shh 信号通路的阻断剂可抑制缺氧条件下脉络膜血管内皮细胞增殖、迁移以及血管管腔形成。选 择性调节 Shh
4、信号可能是 CNV 治疗的新途径。关键词:Sonic Hedgehog;脉络膜新生血管;血管内皮细胞;缺氧25Effect of Sonic hedgehog signaling on the proliferation, migration and tube formation of hypoxic choroid-retinal endothelial cellsHE Hua, LI Guigang30(Department of Ophthalmololgy, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College,HuazhongUni
5、versity of Science and Technology, WuHan 430030)Abstract: 【Objective】Hypoxia and ischemia are thought to play an important role in theformation of choroidal neovascularization (CNV). Sonic hedgehog (Shh) signaling has recently been shown to be involved in the pathological angiogenesis response to ti
6、ssue hypoxia and35ischemic injury. The aim of this study was to evaluate the effects of the Sonic hedgehog signaling on proliferation, migration and tube formation of choroid-retinal endothelial cells under hypoxicconditions.【Methods】In order to evaluate the expression and role of Shh signaling duri
7、ng CNV,our study utilized chemical hypoxia induced by 200M CoCl2 to observe the expression of Shh signaling in hypoxic choroid-retinal endothelial cells (RF/6A cells), mRNA and protein expression40of key genes, including PTCH1, Gli1 and DLL4, in hypoxic RF/6A cells were investigated by real-time PCR
8、 and Western blot analysis. The effects of the Shh signaling on the biological function of hypoxic RF/6A cells during angiogenesis, including cell proliferation, migration and,tube formation, were investigated. 【Results】The results showed that hypoxic conditions lead to upregulation of PTCH1、GLI1、DL
9、L4、HES and HIF-1 expression in RF/6A cells in vitro. the Shh基金项目:教育部新教师基金项目(基金编号 20090142120068)作者简介:何花,女,副教授,副主任医师,研究方向:眼脉络膜新生血管的基础研究. E-mail:helotus626- 10 -45activator (recombinant Sonic hedgehog N-terminals protein, rShh) not only can promote the mRNA and protein expression of PTCH1, Gli1, and D
10、LL4, but also induce the cell proliferation, migration and, tube formation of hypoxic RF/6A cells. On the other hand, the Shh blockade (cyclopamine) can significantly down-regulate the mRNA expression and protein expression of PTCH1, Gli1 and DLL4, furthermore, reduce significantly the cell prolifer
11、ation, migration and,50tube formation of hypoxic RF/6A cells【.Conclusion】The Sonic hedgehog signaling pathway mayact as a cross-talk signaling pathway which controls the expression of the hypoxia-regulated HIF-1a-VEGF-DLL4 cascade in the CNV. .Cyclopamine, acting as a Shh blockade, may represent a n
12、ovel therapeutic alternative drug by blocking the proliferation, migration and tube formation of hypoxic RF/6A cells.55Keywords: Sonic Hedgehog; choroidal neovascularization; endothelial cells; hypoxia0引言脉络膜新生血管(CNV,choroidal neovascularization)是来自脉络膜的病理性新生血管, 它是年龄相关性黄斑变性等多种眼底疾病不可逆性致盲的主要原因1,2。CNV 以往
13、研究的焦60点主要集中在血管内皮细胞(EC)和血管内皮生长因子(VEGF)。在此基础上发展起来的 临床治疗主要倾向于玻璃体腔注射 VEGF 拮抗药物(Macugen、Lucentis 等)和光动力疗法, 前者可抑制 EC 增殖以对抗 CNV 生长,后者则破坏 EC 导致血管栓塞,主要针对已形成的 CNV 晚期的并发病变。尽管两者在一定程度上可改善视力,但仍未达到理想的治疗效果, 患者需要长期反复多次的昂贵治疗,不仅延长了病程,增加并发症发生的风险,而且带来巨65大的精神和经济负担。深入研究 CNV 的发病机制和提供新的治疗靶点是目前眼科的研究热 点。CNV 本质上是新生的病理性微血管,其发生与
14、脉络膜视网膜局部微环境的缺血和低氧 状态息息相关3,4。Sonic hedgehog(Shh)信号通路是近年发现的血管新生的新信号通路, 研究证实 Shh 信号通路是缺血或低氧损伤组织中血管新生的重要调节环节5,6,7,且 Shh 信号70通路(Shh-Ptch-Gli1 通路)调控血管新生的机制与 HIF-1 -VEGF-DLL4 信号通路有关8 。 在体外 CNV 动物模型研究中已发现 Shh 及其下游产物 PTCH1 表达上调7 。那么 Shh-Ptch-Gli1 信号通路如何参与了 CNV 的形成过程?目前这方面的研究报道较少。本实验研究利用体外培养缺氧状态下的脉络膜-视网膜内皮细胞(
15、RF/6A 细胞)来研究缺 氧条件下 Shh-Ptch-Gli1 信号通路的表达变化。并进一步观察 Shh 信号通路的激动剂和阻滞75剂对缺氧状态下 RF/6A 细胞增殖、迁移以及血管管腔形成的影响,从而探讨 Shh 信号通路 参与 CNV 形成的作用机制。1研究方法1.1 细胞培养及缺氧方案从上海中科院细胞库获取脉络膜-视网膜内皮细胞系 (RF/6A 细胞),在含 10%胎牛血清80(Gibco), 100 U/ml 青霉素,100 g/ml 链霉素的 DMEM 培养基培养。血管性血友病因子(SantaCruz Biotech., USA)免疫染色鉴定。细胞缺氧之前给予含 1%胎牛血清的 D
16、MEM 培养,加入 200mol/L CoCl2 形成缺氧环境。 在检测 Shh 信号通路(PTCH1、GLI1)及相关重要调控基因(DLL4、HES1、HDF-1)mRNA 的时程表达规律时 RF/6A 细胞分别低氧培养 6h、12h、24h。在研究体外给予 Shh 信85号通路的激动剂和阻断剂对 RF/6A 细胞相关调控基因表达及细胞增殖、迁移、血管管腔形 成的影响时,RF/6A 细胞低氧培养 12h。1.2 实时定量 PCR由中国上海 Genechem 公司对 PTCH1、GLI1、DLL4, HES1, HIF-1 和 GAPDH 进行引物 设计及合成。引物序列如表 1 所示。利用 A
17、BI PRISM 7500 系统 (Biosystems, USA) ,用90SYBR green (TaKaRa Bio., Japan)对 PTCH1、GLI1、DLL4, HES1, HIF-1 的 mRNA 表达水平 进行实时定量 PCR 检测。每个 cDNA 样本放入含 1 l cDNA,12.5 l SYBR GREEN RT-PCR Master Mix (2), 以及 1 l 引物 (10 mol/L)的 25 l 容器,重复检测三次。实时定量 PCR 检 测步骤包括 95C 10 min 酶反应,95C15 s 变性及 60C1 min 复性共 40 周期,最后 72C20
18、min 延伸。利用相对 Ct (Ct)计算基因表达相对含量(Biosystems 提供), 公式如下: 倍数改变95=2-Ct, Ct 表示信号达到阈值时扩增循环次数。表1 PCR引物序列Tab. 1. Primers used for PCR analysis100Geneprimer sequenceproduct size. bp105110PTCH1 Forward primer: TCTGCTGGGAGTGCTGATG 99Reverse primer: TTGAGAACGCCGAGGATGGGLI1 Forward primer: TTCCTACCAGAGTCCCAAGT 185R
19、everse primer: CCCTATGTGAAGCCCTATTTDLL4 Forward primer: AGGTGCGGACATCCATCG 118Reverse primer: CTGCCCACAAAGCCATAAGGHES1 Forward primer: CTACCCCAGCCAGTGTCAACA 271Reverse primer: AACGCAGTACCGGCGAGTGHIF-1 Forward primer: AGAAAGCAGTTCCGCAAGCC 425Reverse primer: CATGTTCCATTTTTCGCTTTCTGAPDH Forward primer:
20、 ACCACAGTCCATGCCATCAC 452Reverse primer: TCCACCACCCTGTTGCTGTA1151201251.3 蛋白印迹技术(Western blot)RF/6A 细胞放入 6 孔板,给予 12 小时的缺氧环境。PBS 冲洗 2 次后每孔给予 100 l 裂 解缓冲液,4C 冰浴 5min。依据生产商提供说明,用 BCA protein assay kit (Tianlai, China) 测量分析蛋白表达水平。每个蛋白样本 100C 加热 10 min 后载入 5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶, 冰转移缓冲液(25 mmol/L Tris, 192 mmol/L
21、 糖胶, 100% 冰乙醇)中转移至硝酸纤维素膜,5% 脱脂乳封闭,一抗分别为兔抗人、鼠 Patched 多克隆抗体(Abcam 公司产品)、兔抗人、鼠 DLL4 多克隆抗体(Abcam 公司产品)、兔抗人、鼠 GLI1 多克隆抗体(Abcam 公司产品) 以及 GAPDH 一抗(内对照)检测,结合辣根过氧化物酶的抗兔 IgG 孵育。蛋白条带以 GAPDH 标准化。重复测量三次。1.4 体外给予 Shh 信号通路的激动剂和阻滞剂分组干预低氧环境下(200uMCocl2,培养 12 hour)的 RF/6A 细胞进行实验分组,共 4 组。分别 为空白对照组、PBS 液对照组、激动剂干预组(3ug
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