p120ctn 亚型在肺鳞癌、腺癌中表达及意义1【精品论文大全】 .doc
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1、精品论文推荐p120ctn 亚型在肺鳞癌、腺癌中表达及意义1苗原,刘洋,王恩华 中国医科大学基础医学院病理学教研室,沈阳 (110001) E-mail:wangeh摘要:目的 探讨 p120ctn 亚型在肺鳞癌、腺癌中的表达及其与各临床病理因素的关系。方 法 采用免疫荧光和 Western Blot 方法检测肺鳞癌、腺癌及对应癌旁正常肺组织中 p120ctn 各亚型的表达情况。结果 与正常肺组织相比,p120ctn 在肺癌细胞膜表达减弱,呈现胞膜荧光不连续或缺失,胞浆内存在 p120ctn 的蓄积。正常肺组织中 p120ctn 总蛋白量明显高于肺癌组织(P0.001)。p120ctn 蛋白以
2、亚型 1(120KD)和亚型 3(100KD)表达为主,而在肺癌组织则 出现 1、3 亚型表达缺失或减弱(P=0.001, P0.001)。并且亚型 3 的这种缺失或减弱的现象与肺癌的淋巴结转移负相关(P=0.005)。结论 p120ctn 亚型 1 和 3 的蛋白表达的减弱或缺失是肺癌的普遍现象,且这种现象与淋巴结的转移相关。 关键词:p120ctn 亚型,肺癌,免疫荧光,Western Blot中图分类号:R361p120ctn 作为连环素家族的新成员,在细胞黏附和信号转导中起着至关重要的作用 1-4。 它的基因有 21 个外显子,根据其剪切的不同,理论上 p120ctn 可产生 32 个
3、亚型,所有的亚 型都具有相同的犰狳(Armadillo)重复序列,只是 C 端或 N 端不同5。根据其起始翻译密码的 不同人类的 p120ctn 可分为 4 种亚型,但各亚型的生物学功能至今尚未阐明6,7。目前 p120ctn 在人肺癌中的研究很少,其在肺癌中表达的亚型种类及表达情况仍不清楚。本研究采用免疫 荧光和 Western Blot 方法,观察了 p120ctn 及其各亚型在肺鳞癌、腺癌中的表达及意义,并探 讨其与肺癌的临床病理因素的关系。1. 材料与方法1.1 材料50 例原发性肺癌及对应癌旁正常肺组织来自 2003 年 11 月至 2004 年 9 月在中国医科大 学第一附属医院行
4、外科手术切除的新鲜标本。 患者术前均未接受过放化疗。标本取出后立 即放入-70冰箱保存备用。其中男 37 例,女 13 例,平均年龄 59 岁(32-78 岁)。按 2004 年 WHO 肺肿瘤组织学分类标准8,鳞癌 15 例,腺癌 35 例;高分化 12 例,中分化 23 例, 低分化 15 例;有淋巴结转移 22 例,无淋巴结转移 28 例。依据国际抗癌联盟(UICC)1999 年 修订的肺癌 p-TNM 分期标准9 :期 13 例,期 10 例,期 27 例。1.2 方法1.2.1 冰冻组织切片和免疫荧光染色观察取新鲜肺癌和癌旁正常肺组织标本 OCT 包埋,快速冷冻后制成 5m 厚的切片
5、,贴附于 涂有多聚赖氨酸的载玻片上,冷丙酮固定 10min 后晾干备用。固定后的冰冻组织切片用 0.2% Triton X-100 处理 15min。正常非免疫动物血清 37孵 育 30min。滴加 p120ctn 鼠抗人单克隆抗体(1:400,BD Transduction Laboratories),4孵育 过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,每次 5min,重复三次。滴加罗丹明标记羊抗鼠荧光标 记二抗(1:200,北京中杉),37孵育 30 分钟。PBS 冲洗,每次 5min,重复三次。DAPI (1:200,1 本课题得到国家自然科学基金(30670917)和教育部博士点基金(20040
6、159008)资助。- 7 -SIGMA 公司)核复染 30min;PBS 冲洗;50%甘油封片,荧光显微镜于波长为 527nm 处观察罗丹明荧光强度,于 372nm 波长处观察 DAPI 的荧光染色,确定 p120ctn 的表达及定位。1.2.2 Western Blot从新鲜肺癌和癌旁正常肺组织标本中取 0.125cm3 左右大小的组织块,加入 500L 裂解 液中冰浴下匀浆,4静置 24h,低温高速离心(4、13000 转/分、30min),收集上清。 用考马斯亮兰法,以牛血清蛋白作为标准进行蛋白定量,计算各样品蛋白浓度。将含 50g 总蛋白的组织裂解产物进行 SDS-PAGE 电泳 1
7、.5h 后,转印至 PVDF 膜(100V,2h),5%脱脂奶粉室温封闭 1h,经 TTBS(20mmol/L Tris-HCL,500mmol/L NaCL,0.05% Tween-20)冲洗 3 次,抗 p120ctn 单克隆抗体(1:400,BDTransductionLaboratories)4 孵育过夜后,辣根过氧化物酶标记二抗 37孵育 1h,TTBS 洗三次后 DAB 显色。以 -actin 为内对照,用凝胶成像分析系统(Biolmaging Systems,美国)测定 p120ctn 各条带灰度值,并 取其与 -actin 的比值为相对表达量分析 p120ctn 各亚型的表达情
8、况。1.3 统计分析利用 SPSS for Window 11.5 进行统计分析。p120ctn 及其亚型在正常支气管上皮和癌中表 达的关系采用 Wilcoxon 符号检验, p120ctn 及其亚型表达与临床病理因素的关系采用 Spearman 秩相关检验,P0.05 有统计学意义。2. 结果2.1 免疫荧光结果p120ctn 在癌旁正常肺组织中的支气管上皮细胞胞膜上强表达,呈现完整、连续的红 色强荧光,而在肺癌细胞中 p120ctn 的膜荧光表达明显减弱,呈现不连续或缺失,并可出现 胞浆表达(图 1)。2.2Western Blot 结果参照预染蛋白分子量标准(赛百盛,北京,中国),在癌旁
9、正常肺组织可见 100KDa 和120KDa 附近有特异性的条带,对应位置相当于 p120ctn 的亚型 1(120KDa)和 3(100KDa),而 在肺癌组织中亚型 1 和 3(尤其是亚型 1)多表现为缺失或减弱(图 2)。对 Western Blot 图像结果的分析表明,包括 1 和 3 亚型在内的 p120ctn 总蛋白在癌旁正常 肺组织中的表达明显高于肺癌组织(P0.001,n=50)。p120ctn 的亚型 1 和亚型 3 在癌组织中 的表达均有不同程度的缺失或减弱(P=0.001,n=50;P0.001,n=50)。亚型 1 的缺失与各 临床病理因素无关,而亚型 3 的表达缺失与
10、淋巴结转移呈负相关(P=0.005,n=50,r=0.397), 与其他临床病理因素无关(表 1)。3. 讨论我们以往的研究 10-12显示 p120ctn 在正常肺组织中,主要以细胞膜表达为主,而在肺癌 组织中则出现细胞膜表达下降,并伴有细胞浆或细胞核表达。我们应用免疫荧光法观察其在 组织冰冻切片中的表达,其结果与我们以往的研究和在其它肿瘤中的报道13-17相似。在正常 的肺组织中,p120ctn 于胞浆近胞膜域参与上皮钙黏素(E-cadherin)复合体的组成,进而稳 定细胞间的黏附,因而我们观察到 p120ctn 在细胞膜上呈完整、连续的较强的红色荧光;而 在肺癌组织中,p120ctn
11、的膜表达减弱,出现荧光的不连续或缺失。这可能是由于肿瘤细胞中的 p120ctn 从 E-cadherin 复合体中解离出来的结果,这一结果可破坏细胞间的黏附功能,从 而利于肿瘤细胞的侵袭和转移。脱离了复合体的 p120ctn 可转向胞浆内,所以我们可以在细胞浆内可以检测到它的蓄积。目前,p120ctn 在细胞黏附过程中的确切作用机制存在着很大争议18,19,其中原因之一就 是由于 p120ctn 具有多种亚型的存在,并且这些亚型的表达具有组织特异性19-21。理论上,根据剪切不同,人类的 p120ctn 可以产生 32 种亚型,而且在不同的组织和细胞 类型中 p120ctn 亚型的剪切方式是不
12、同的。根据起始翻译密码 ATG 在 N-端的不同位置,p120ctn 可分为亚型 1-4,根据外显子 A、B、C 在 C-端不同应用又可将这四种亚型分为多种次亚型。 由于这些剪切方式只影响到 N-端和 C-端,其间的犰狳重复序列并未受到干扰,因而,它可 以保持完整结构从而与 E-cadherin 相连18,19。通过这种结合方式,p120ctn 的各种亚型都可以 与 E-cadherin 结合,进而对 E-cadherin 复合体介导的细胞黏附进行调节。但关于 p120ctn 各亚 型的具体生物学功能及确切作用机制至今仍不清楚。尽管在人类正常组织中,可检测到 1-4 四种 p120ctn 亚型
13、20,但我们检测了癌旁正常肺组织后发现,只在 120KD 和 100KD 处检测 到两条特异性的条带,对应其位置相当于 p120ctn 的 1、3 两种亚型,并没有检测到明确的 2 和 4 亚型的表达。这一结果提示,p120ctn 亚型 1 和亚型 3 在肺组织内有较好的特异性表达。 与癌旁正常肺组织相比,肺癌组织中 p120ctn 总蛋白的表达量明显减少,这与 Skoudy 等人22 在结直肠癌中研究的结果类似。但是,p120ctn 总蛋白的表达与肺癌组织的分期、分化等临床 病理因素并无任何相关性。为了深入探究 p120ctn 在肺癌组织中的亚型表达及其意义。我们 分别对 p120ctn 亚
14、型 1、3 的表达量进行统计分析,结果表明:肺癌组织中亚型 1 的表达量明 显低于它在癌旁正常肺组织中的表达量,但是,我们没有检测到它的表达与各临床病理因素 相关。亚型 3 在癌组织中表达也明显低于正常肺组织,与亚型 1 不同的是,亚型 3 的减少没 有亚型 1 明显,而且它的表达缺失与淋巴结转移呈负相关,与其它各临床病理因素无关。从 Western Blot 结果我们可以得出这样的推论:p120ctn 亚型 1 与亚型 3 可能是肺组织中主要表 达的亚型,它们的表达可能与肺癌细胞的恶性程度有关,而且,这两种亚型对癌细胞恶性表 型的影响可能也是不同的。从统计结果可以看出:在分化程度较好,无淋巴
15、结转移的癌组织 中,亚型 3 的缺失较多。也就是说,亚型 3 很可能会有促进癌细胞向恶性表型转化的作用, 而亚型 1 的作用并不明显。从我们的实验结果可以看出,在癌旁正常肺组织中 p120ctn 主要以亚型 1 和亚型 3 的表 达为主,在肺癌组织中这两种亚型可以出现不同程度的缺失或减弱。并且它们各自的缺失程 度可能对癌细胞的恶性表型有不同的影响:亚型 1 的表达缺失可能会促进癌细胞的恶性表 型,而亚型 3 的表达缺失很可能会抑制癌细胞的恶性表型。那么在肺癌组织中,p120ctn 浆表 达是否与亚型 3 的表达具有一致性呢?亚型 1 和 3 的表达在影响癌细胞恶性表型方面究竟怎 样发挥各自的生
16、物学功能呢?这些还需要我们去做更深层的研讨。参考文献1Reynolds AB, Daniel J, McCrea PD, et al. Identification of a new catenin: the tyrosine kinase substrate p120cas associates with E-cadherin complexes J. Mol Cell Biol, 1994, 14(12): 8333-8342.2Yap AS, Niessen CM, Gumbiner BM. The juxtamembrane region of the cadherin cytopla
17、smic tail supports lateral clustering,adhesive strengthening,and interaction with p120ctn J. J Cell Biol, 1998, 141(3):779-789.3Hatzfeld M. The p120 family of cell adhesion molecules J. Eur J Cell Biol, 2005, 84(2-3): 205-214.4Myster SH, Cavallo R, Anderson CT, et al. Drosophila p120 catenin plays a
18、 supporting role in cell adhesion but is not an essential adherens junction component J. J Cell Biol, 2003, 160(3): 433-449.5Anastasiadis PZ, Reynolds AB. The p120 catenin family:complex roles in adhesion, signaling and cancerJ. J Cell Sci, 2000, 113(Pt 8): 1319-1334.6Aho S, Levansuo L, Montonen O,
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