DON 毒素的提取、纯化1.doc

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1、精品论文推荐DON 毒素的提取、纯化1尹珺，张爱华，何成华，张海彬* 南京农业大学动物医学院，江苏南京（210095） E-mail：haibinzh摘要：为了获得大量的、高纯度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），选择来源于赤霉病小 麦的禾谷镰刀菌进行培养，结果发现，禾谷镰刀菌在约含 25水的小麦培养基中 25振荡 培养，DON 产量与培养天数呈近似抛物线关系，培养 10 天后，DON 产量直线上升，30 天达最高值，此后便迅速下降。收集培养基，经过在乙腈水（84:16）溶液中振荡、过滤、石油醚脱脂、乙酸乙酯萃取、蒸发，并通过以无水硫酸钠加上弗罗里硅土为填料的层析柱提 取纯化得到了高纯度的 DON

2、 毒素，为该真菌毒素的深入研究提供了基础。 关键词：禾谷镰刀菌；培养 DON；提取；纯化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，缩写 DON)又称呕吐毒素(vomitoxin)，属单端孢霉 烯族 B 族化合物。联合国粮农组织和世界卫生组织 1973 年联合召开的第三次食品添加剂和 污染物会议上，单端孢霉烯族毒素被定为最危险的自然发生食品污染物，列入国际研究的优 先地位。而其中 DON 污染粮食最为普遍，严重危害人畜的安全，越来越受到国内外的重视 1-3。DON 毒素与其他单端孢霉烯族毒素一样，属天然产物，极难通过人工合成途径获得。 DON 的主要产生菌是禾谷镰刀菌(Fusarium

3、graminearum)，据报道还有其它一些镰刀菌也可产生 DON，如粉红镰刀菌（F.roseum）、黄色镰刀菌(F.culmorum )、雪腐镰刀菌(F. nivale )、 燕麦镰刀菌(F. avenaceum)和串珠镰刀菌 (F. moniliforme等。而禾谷镰刀菌(F.graminearum) 是小麦赤霉病与玉米穗腐病的重要病原菌，大多在低温、潮湿和收割季节，在谷物庄稼中慢 慢生长1。DON 一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度，在黑麦、高梁、大米 中的浓度较低4。从赤霉病麦上分离出来的禾谷镰刀菌，固体培养基常用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培 养基或马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培

4、养基，液体培养基常用察氏液体培养基，产毒培养基常 用天然小麦或玉米培养基5。本文将从赤霉病麦上分离出来的禾谷镰刀菌，接种到 PDA 固 体培养基或察氏液体培养基，进行菌丝生长观察，并将孢子接种到产毒培养基天然小麦 培养基，在不同时间检测 DON 产量，以期获得最佳产毒条件。利用毒素探讨小麦对赤霉病的抗性机制，筛选抗病突变体，研究 DON 对人、畜的危害， 开发新的快速检测技术等已取得了进展6-9。因此，毒素的大量制备与提取已成为上述研究 工作的先决条件。本试验通过对禾谷镰刀菌小麦培养基中 DON 毒素的提取法进行研究，建 立了一套简便、经济、高效的 DON 毒素提取方法，为 DON 的深入研究

5、和应用提供基础。1. 材料与方法1.1 实验菌株禾谷镰刀菌，由南京农业大学陈利锋教授提供。1.2 试剂与溶液配制1.2.1 试剂三氯甲烷、石油醚(6090C)、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、无水硫酸钠等均为分1本课题得到国家自然科学基金项目（30471277）、教育部博士点基金项目（20040307043）和江苏省科技 公关项目（BE2004317）的资助。- 6 -析纯；弗罗里硅土（硅镁吸附剂，100200 目）经 120C 活化 2h 备用。1.2.2 溶液配制察氏液体培养基： NaNO3 3.0g，KH2PO4 1.0g，KCl 0.5g， MgSO47H2O0.5g，FeSO4 0.01g，蔗

6、糖 30.0g，蒸馏水 1000mL，pH 调至 6.0。接种时加适量硫酸链霉素，10g 蛋白胨，以促进产毒。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL。 马铃薯去皮后包上纱布煮开，调整 pH 至 8.0，115C 灭菌 20min。小麦培养基：将小麦晾干，粉碎至末状。称取 50g 粉碎样品置于具棉塞的 250mL 锥形 瓶中，高压灭菌。加入 1214mL 灭菌蒸馏水，充分搅拌均匀。1.3 禾谷镰刀菌的培养1.3.1 接种禾谷镰刀菌于察氏液体培养基或 PDA 平板，25C 培养数天，观察禾谷镰刀菌的生 长情况。1.3.2 吹打禾谷镰刀

7、菌察氏液体培养基，使孢子混匀，接种 2mL 于 50g 小麦培养基，25C 霉 菌培养箱中培养，经常摇匀培养基。于培养的第 10d、20d、30d、40d、50d，随机取 5 个培 养瓶置 80C 下杀菌 1h，烘干粉碎后进行 DON 的提取和 HPLC 定量分析。1.4 DON 的提取取样品 50g，加 100mL 乙腈水（84:16）振荡 30min（重复 12 次），过滤到分液 漏斗，加约两倍体积石油醚脱脂，弃上层石油醚，收集下层乙腈水层，90C 水浴挥干， 少量乙酸乙酯溶解，离心，取上清夜过柱（乙酸乙酯甲醇（95:5）洗柱），90C 水浴减 压挥干，1.5mL 乙酸乙酯溶解残渣，离心，

8、并转入定容瓶中，吹 N2 挥干，乙腈（氯仿）定 容至 0.5mL。同时，用乙酸乙酯水，甲醇水代替乙腈水（84:16）进行提取，用无水 硫酸钠+弗罗里硅土作为填料过柱纯化后 HPLC 定量分析，比较三种提取液的效果。1.5 DON 的纯化1.5.1 层析柱制备：在层析柱底部加入适量玻璃棉或脱脂棉，加入 10m1 乙酸乙酯甲醇溶 液。用无水氧化铝+活性炭或无水硫酸钠+弗罗里硅土按下列顺序湿法装柱:无水硫酸钠或 无水氧化铝 1.5g弗罗里硅土或活性炭 8g无水硫酸钠或无水氧化铝 2g脱脂棉少量。1.5.2 过柱、洗脱：当柱内溶剂液面降至上层脱脂棉与无水硫酸钠界面时，用移液管将澄清 的提取液移入柱内，

9、用少量乙酸乙酯甲醇溶液淋洗刻度试管移入柱内。当液面再次降至脱 脂棉与无水硫酸钠界面时，分次加入 150mL 乙酸乙酯甲醇溶液，洗脱速度控制在0.5mL/min 左右，接收洗脱液至圆底烧瓶中。于旋转蒸发器上减压浓缩至干，得到 800L DON层析纯浓缩液，HPLC 定量分析。2. 结果2.1 PDA 平板培养结果由图 1-A，B 可见，禾谷镰刀菌在 PDA 平板上 37 C 培养 3 天，气生菌丝生长旺盛， 呈白色，菌落基质呈白色，部分基质呈红色。禾谷镰刀菌培养 8 天，气生菌丝生长旺盛，长 满平板，菌落基质呈红色，部分基质呈深红色（图 1-C，D）。ABCD图 1 禾谷镰刀菌在 PDA 平板上

10、培养 3 天(A,B)和 8 天(C,D)的菌落A，C：正面；B，D：反面Fig. 1 Bacterial colony of Fusarium graminearum on PDA plate after three (A,B) or eight (C,D) days cultivationA，C：the obverse side；B，D：the reverse side2.2 察氏液体培养基培养结果禾谷镰刀菌属于需氧菌，在察氏液体培养基中在 25 C 恒温气浴振荡条件下，由于能吸 收到大量的氧气，该菌生长更加旺盛，在液面以下菌丝生长旺盛。图 2 禾谷镰刀菌在察氏液体培养基中培养 7 天的菌

11、落Fig. 2 Bacterial colony of Fusarium graminearum in Czapek liquid medium after seven-days cultiviation2.3 产毒量与时间的关系从图 3 可以看出，DON 产量并非随培养天数的增加而提高，而是呈近似抛物线型关系。 在 30 天左右产毒量最高，30 天以后，DON 产量迅速下降。毒素含量（g/g）60040020000102030405060 时间（天）time (d)图 3 禾谷镰刀菌产毒量与培养时间的关系Fig. 3 The relationship between the output o

12、f DON and cultivation time of Fusarium graminearum2.4 DON 的提取通过试验比较三种萃取溶液，发现用乙腈水（84:16）分步提取法获得的粗毒素 DON的提取效率高，是一种较为简便、经济、高效的禾谷镰刀菌粗毒素提取法（表 1）。表 1 用三种提取液粗提 DON 方法的比较Table.1 Comparison of the efficiency with three extraction solution for extracting DON提取液提取溶液描述过柱后 DON 的提取量氯仿无水乙醇（75:15） 甲醇水（20:80） 乙腈水（84

13、:16）溶液浑浊,难过滤 溶液浑浊,难过滤 溶液澄清,透明,易过滤28.6mg/kg30.4 mg/kg42.1mg/kg2.5 DON 的纯化比较 DON 的国家检测标准毒素提纯用的层析柱填料无水氧化铝+活性炭和其他毒 素提取常用的无水硫酸钠+弗罗里硅土层析柱填料，活性炭填料吸附柱虽然使样品的杂质减 少了，但回收率有下降趋势，且过柱时间很长。弗罗里硅土填料吸附柱不仅使杂质显著减少， 而且回收率较高，过柱时间较短。故采用弗罗里硅土吸附柱净化效果较好（表 2）。表 2 DON 两种层析柱提取方法的比较Table.2 Comparison of the efficiency with two co

14、lumns for extracting DON方法纯化效率过柱时间过柱后 DON 的提取量无水氧化铝+活性炭无水硫酸钠+弗罗里硅土溶液杂质较多溶液较澄清24 小时约 8 小时32.9mg/kg40.5 mg/kg3. 讨论3.1 禾谷镰刀菌的培养及产毒相关条件本试验发现，用棉塞代替橡胶塞，使得禾谷镰刀菌处于有氧、半开放的环境中，大大促 进了其生长。小麦培养基加约25水利于禾谷镰刀菌生长。禾谷镰刀菌适宜在潮湿的环境中 生长，而当超过这个比例后，不利于镰刀菌生长,可能是影响了氧气的吸收。陆鸣等报道， DON产量是呈近似抛物线型关系。是由于DON的转化还是降解，其机理尚待进一步探讨10。 本人通过

15、反复实验，证实了DON的产量随培养天数呈抛物线型关系的观点。3.2 DON 的提取和纯化DON 易溶于水和极性溶剂甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，但不溶于正己烷和乙 醚。而且 DON 对热较稳定，一般的烹调及加热不能破坏其毒性。正是利用它的这些特性， 使 DON 得以从烘干粉碎的霉变小麦中萃取出来11。DON 的纯化除了本试验所用的两种层 析柱填料以外，免疫亲合柱所具有的灵敏度高、选择性好、耗时少、使用方便和节省溶剂等 优点，正成为真菌毒素分析的一种重要的前处理手段，得到越来越广泛的应用。免疫亲和柱 的主要缺点是价格较高，目前还只有几种真菌毒素有商用免疫亲合柱，有的样品上柱前还需 先净化，有

16、时还存在回收率较低的问题。免疫亲合柱适用于自然条件下生长的谷物中的毒素 检测，目的是调查赤霉病的污染情况12。而本试验目的是得到大量高纯度的 DON 毒素，培 养基中所含的毒素远远高于自然条件下赤霉病污染的谷物，也远远超过免疫亲合柱最大吸附 毒素量，所以不适宜用免疫亲合柱。总之，本文建立了禾谷镰刀菌最佳产毒培养方法，并用乙腈水（84:16）分步提取法 获得粗毒素 DON，采用弗罗里硅土吸附柱净化杂质少，回收率高，过柱时间较短。用该法 可以获得大量 DON，为开展与 DON 相关的研究提供原料。参考文献1 Larsen JC, Hunt J, Perrin I, et al. Workshop

17、on trichothecenes with a focus on DON: summary reportJ.Toxicology Letters,2006, 153 (1):1-22.2 Pfohl-Leskowicz A. Mycotoxins - Food Safety Aspects Euro-Maghrebin SymposiumJ. Mol Nutr Food Res.2006, 50(6):467-469.3 Martins ML, Martin HM. Determination of in wheat-based breakfast cereals marketed in P

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20、mycotoxin adsorbentJ. J Anim Sci. 2002, 80(12):3257-3267.8 Le Drean G, Auffret M, Batina P, et al Myelotoxicity of trichothecenes and apoptosis: an in vitro study on human cord blood CD34+ hematopoietic progenitorJ. Tociol In Vitro. 2005, 19(8): 1015-1024.9 尹珺，张洪英，张海彬，等. 脱氧血腐镰刀菌烯醇（DON）理化检测方法的研究J. 畜牧

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22、8(2): 117-120.Isolation and Purification of DeoxynivalenolYin Jun, Zhang Aihua, He Chenghua, Zhang HaibinCollege of Animal Medicine, Nanjing Agriculture University, Jiangsu Nanjing (210095)AbstractFusarium graminearum was cultured in order to obtain a plenty of DON with high purity. The mostsuitable

23、 condition for Fusarium graminearum producing DON is that Fusarium graminearum was shaking cultured under 25 in wheat medium containing 25% water. The production of DONincreased greatly after ten days and reached the top at thirty days, and dropped after that. The cultured wheat were collected and e

24、xtracted with acetronile-water (84:16,V/V) ，and then purified by achromatography column with Florisil and anhydrous sodium sulfate as fillings. At last, plenty of DONwith high purity was obtained, which provided the basis for further researches on DON.Keywords: Fusarium graminearum; Cultivation; Deoxynivalenol; Isolation; Purification作者简介：张海彬(1957-)，男，通讯作者，微生物学博士，教授，博导，主要从事动物中毒 病和真菌毒素的研究兼教学工作。