乙肝两对半检测中南京.ppt

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1、乙肝两对半免疫学检测相关问题研讨,中山三院检验科李林,HBV感染的实验室检测是目前国内最为常见的检验项目，也是医患纠纷产生较多的领域之一。卫生部临床检验中心 李金明乙肝两对半：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。检测结果：定性、半定量、定量。试剂原材料：抗原（天然抗原、重组抗原）、抗体（单抗、多抗、Fab）。检测技术：ELISA、化学发光、时间分辨荧光、免疫层析等。检测方法：夹心法（一步法，两步法），竞争法（固相液相竞争法，液相液相竞争法等）。,一、HBsAg方法：双抗体夹心法：两步法，一步法。试剂原材料：HBsAb（McAb、PcAb）或其酶解产物 Fab。,双抗体夹

2、心法模式：,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,HBsAg抗原表位1、共同决定簇：a（aa124-147）；2、型特异决定簇：（1）d/y（aa122，赖氨酸/精氨酸）；（2）w/r（aa160，赖氨酸/精氨酸）；四种亚型：adr、adw、ayr、ayw。,检测中常见的问题,1、一步法测定中的钩状效应（Hook effect）：,一步法检测时，受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及标记抗体结合，而不能形成“固相抗体抗原标记抗体”夹心复合物。此时反应后的检测信号位于抗原过剩带上，与标准曲线位于抗体过剩带上的某一抗原浓度的检测信号相同，如按抗体过剩带上的检测信号测读，所得结果将低于实际的含量，

3、这种现象称为钩状效应。钩状效应严重时，可出现假阴性结果。,双抗体夹心一步法的钩状效应（示意图）:,固相载体,固相Ab,Ag,标记Ab,钩状效应时分析浓度与检测信号关系图：,检测信号,抗体过剩带,抗原过剩带,抗原分析浓度,HBsAg检测试剂原材料与钩状反应的关系：原材料：HBsAb。多克隆抗体：免疫动物或直接从感染者血清中所获得，来源于不同的B细胞克隆，可含有针对同一抗原分子不同的抗原表位（a、d/y、w/r）的多种定向抗体。单克隆抗体：由一株B细胞杂交瘤产生的只针对某一特定的抗原表位的高度均一，高度专一性的抗体。,McAb制备的试剂受钩状效应的影响较PcAb为轻：,Ig的一个Fab片段只能与一

4、个抗原表位结合。McAb为针对同一抗原表位的均一抗体分子群。HBsAg分子虽具有三个不同的表位(a、d/y、r/w)，但一分子HBsAg同样的表位只有一个，只能封闭一个单体McAb的一个抗原位点，两分子抗原才能封闭一个McAb单体。而PcAb为针对同一抗原不同表位抗体分子群(抗a、抗d/y、抗w/r)，一分子HBsAg上不同的表位可同时与针对不同表位的两个以上单体PcAb结合，其封闭作用的效率高于对McAb。,McAb试剂的钩状效应,固相载体,McAb(抗a),Ag,标记McAb(抗d),PcAb试剂的钩状效应,固相载体,McAb(抗a),标记McAb(抗r),标记McAb(抗d),钩状效应是

5、HBsAg一步法检测时不可避免的现象；由于钩状效应的存在，一步法检测HBsAg所得到的检测信号无法确定其真实性；解决勾状效应的根本方法为固相抗体与抗原反应后分离游离抗原，再加标记抗体的两步法检测：第一步：包被抗体捕获抗原成为固相，然后分离游离抗原；第二步：固相抗原与标记抗体结合，分离液相标记抗体后记录检测信号。,两步法检测：,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,两步法检测时目的检测物浓度和检测信号关系曲线,检测信号,分析浓度,易误解为两步法的一步法检测：1、标本生物素化抗体标记抗体生物素化抗体抗原标记抗体复合物；2、加入亲和素包被的固相载体固相生物素化抗体抗原标记抗体复物；3、洗涤，判读结果。,2

6、）人抗鼠抗体效应(Human anti-mouse effect,HAMA效应)对检测的干扰,产生HAMA的原因：,经常接触老鼠；肿瘤病人进行鼠单克隆抗体的治疗。,用鼠源McAb检测HBsAg时，如样品中有 HAMA，就会产生假阳性或假阴性。,非鼠源的PcAb可消除HAMA效应，IgFab（Fab)可消除HAMA引起的假阳性。,HAMA效应的假阳性模式：标本中的人抗鼠抗体分别与固相HBsAb和标记HBsAb McAb结合，形成固相HBsAbHAMAHBsAb复合物（双抗原夹心），提供假阳性检测信号。,固相载体,固相McAb,标记McAb,人抗鼠抗体,Human Anti-Mouse Antib

7、odies(HAMA),HAMA效应的假阴性模式:,Figure 3-6 How HAMA generates a false negative,3)S基因突变引起的HBsAg漏检：,基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个氨基酸置换、缺失或插入，HBsAg 蛋白质氨基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化。变异率高，自然变异和免疫逃避，变异无地域性。HBsAg抗原性发生改变，不能被野生型HBsAb所识别。此时用一般的国产试剂盒可能检不出。,能导致HBsAg阴性的S区变异 145甘氨酸 精氨酸 aa124 半胱氨酸 酪氨酸 aa129 谷氨酸 天冬氨酸 aa131 苏氨酸 天冬氨酸 aa131 蛋

8、氨酸 苏氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失 不一定HBsAg抗原性发生改变后就一定漏检。很多时候野生型与突变型是混合存在的，这种情况虽然有突变，同样可以检出。,4)RF引起的假阳性 RF是一种自身抗体，能和多种动物IgG的Fc段结合。由于固相抗体和标记抗体均为IgG，双抗体夹心法测抗原可能有RF的干扰，产生假阳性。,固相载体,固相IgG,标记IgG,RF,解决办法：用IgG的Fab 或F(ab)片段作酶结合物替代完整的IgG；标本用联有热变性IgG的固相吸附剂(G蛋白)处理；将热变性IgG加入到标本稀释液中；离心分离IgM和IgG；加入羊抗人IgG。鼠源单克隆抗体对RF

9、的亲和力较低，也能明显地降低RF对结果的干扰。,McAb和PcAb在HBsAg检测中的应用,McAb：优点：在一步法检测中能减轻钩状效应；便 于人为处理和质量控制。缺点：HAMA效应，灵敏度比不上PcAb。,PcAb：优点：免疫反应性好于McAb，作为标记抗体，PcAb可能提供更强的检测信号，达到更高 的灵敏度；非鼠源PcAb 无HAMA效应。缺点：一步法检测时钩状效应明显。,固相载体,HBsAg McAb（“a”）,HBsAg McAb（“a”）,标记McAb（抗“d”）,标记PcAb（抗“r”）,McAb和PcAb在检测HBsAg（adr）时抗原抗体结合示意图,标记PcAb（抗“d”）,H

10、BsAg,标记McAb（抗“d”）,上述情况是指只采用一种McAb的情况，如果采用两种针对不同表位的McAb，可以提高灵敏度，但同时也和PcAb一样，会发生明显的钩状效应。,常见HBsAg检测情况：ELISA检测模式：一步法。原材料：McAb；检测结果：定性。缺点：钩状效应，灵敏度较差，HAMA干扰、RF干扰，不能定量。化学发光检测模式：一步法。原材料：McAb(Fab)；检测结果：定量。灵敏度好于ELISA，无RF干扰。缺点：钩状效应，HAMA干扰，定量结果不能溯源到国际标准。,Abbott检测模式：两步法。原材料：McAb(固相捕获抗体），PcAb（Fab，标记抗体）；检测结果：定量。优点

11、：1）无钩状效应；2）无HAMA、无RF干扰；3）灵敏度高；4）加用了针对不同突变株病毒抗原的检测抗体，可以进行HBsAg突变株的检测；5）定量结果可溯源到国际标准。时间分辨荧光检测模式：两步法。原材料：McAb(固相捕获抗体），PcAb（标记抗体）；检测结果：定量。特点：无钩状效应；灵敏度高；无HAMA干扰。不能进行HBsAg突变株的检测,可能有RF干扰，定量结果不能溯源到国际标准。,目前国际上常用的HBsAg标准物质：Paul Ehrlich Institute 参考物:PEI/ml;法国参考物：ng/ml;雅培参考物：ng/ml（Axsym),IU/ml(i2000)；NIBSC参考物：

12、IU/ml.（英国国家生物标准与检定所，National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)1 IU/ml=0.58PEI/ml=1.93“法国”ng/ml=5.59雅培ng/ml,二、HBsAb 原材料：HBsAg1、天然HBsAg：血源的纯HBsAg，即S蛋白（小球形颗粒）；,HBsAg小球型颗粒（2022nm）Dane颗粒（40 42nm)管型颗粒,2、基因工程重组抗原（rHBsAg)。,HBsAb为分别针对HBsAg五种表位（a、d/y、w/r）的不同抗体，其中90%的HBsAb为针对“a”的抗体，为最重要的保护性

13、体，对不同亚型感染均有保护作用（但交叉免疫不完全），也是HBsAb各种抗体中最重要的血清标志物。用于检测HBsAb的抗原，无论天然抗原或重组抗原，必须具有“a”表位，一般为ad、ay亚性联合应用。HBsAb试剂原材料质量优良，检测方法为双抗原夹心法，定量定性检测的结果均准确可靠。,可能出现的问题：如包被物和酶标记物均使用血源球形颗粒，在提取过程中混入Dane颗粒会影响检测结果的特异性。原因：Dane颗粒核心结构中的HBcAg暴露；HBcAg降解为HBeAg抗原。,乙型肝炎病毒（Dane颗粒）结构模式,L蛋白,M蛋白,S蛋白,C蛋白,Dane颗粒暴露的HBcAg和降解生成HBeAg在制备的试剂中

14、也同时作为固相抗原和标记抗原。此时检出的HBsAb，可能并非真阳性，而是HBcAg或/和HBeAg夹心检出的HBcAb或/和HBeAb。,固相载体,HBsAg,HBsAb,标记HBsAg,HBcAg,HBcAb,标记HBcAg,假阳性结果,此时HBsAb假阳性结果将使两对半检测模式产生误差：1、HBsAg+HBsAb+HBeAg+HBcAb阳性；2、HBsAg+HBsAb+HBeAb+HBcAb阳性。,HBsAg阳性+HBsAb阳性模式讨论在HBV感染及机体免疫过程中，可能有HBsAg和HBsAb同时存在的短暂过程，但很难出现在检测过程中：HBsAg过剩时，HBsAb与其结合，以抗原抗体复合物

15、形势存在，血中测不到游离抗体。HBsAb过剩时，HBsAg以抗原抗体复合物形势存在，血中测不到游离抗原。由于抗原抗体反应是可逆的，在检测灵敏度大幅提高的情况下，上述情况不能绝对化。,HBsAg阳性+HBsAb阳性+HBcAb阳性模式解释：“不同亚型HBV感染”。两株不同亚型HBV感染及机体免疫过程：1、两株不同亚型HBV同时或先后感染同一个体，合成两种不同亚型的HBsAg1和HBsAg2；2、前者刺激机体产生HBsAb1，后者未刺激机体产生HBsAb2；3、HBsAb1中和了相应的HBsAg1而不能中和HBsAg2,HBsAg2与HBsAb1同时存在。,出现HBsAg和HBsAb同时阳性应具体

16、分析：90%的HBsAb为针对“a”的抗体，对不同亚型感染均有保护作用，虽然交叉免疫不完全，但出现机率极低；如因不同亚型HBV感染，交叉免疫不完全，而出现HBsAg和HBsAb同时阳性，此时一般试剂也无法检出(用于检测HBsAg的HBsAb中，并无针对特殊亚型HBsAg的HBsAb)；更为合理的解释是：部分HBV的S基因突变引起“a”决定簇氨基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化，野生株抗HBs不能将其清除。进口试剂可能检出。,常见HBsAb检测情况：ELISA原材料：天然抗原。检测模式：一步法。检测结果：定性，半定量。缺点：可能出现假阳性，定量不准。化学发光原材料：天然抗原。检测结果：定量。

17、检测模式：一步法。,Abbott原材料：重组抗原。检测模式：两步法。检测结果：定量。时间分辨荧光原材料：天然抗原。检测模式：两步法。检测结果：定量。,三、HBeAg原材料：McAb HBeAb。检测方法：双抗体夹心法(一步法，两步法)。目前HBeAg检测中，存在明显的假阴性结果：1、一步法检测钩状效应(主要原因)；2、灵敏度差。HBeAg是诊断、治疗检测、预后估计重要的指标，但目前的阴性结果并未引起足够的重视。,常见HBeAg检测情况：ELISA检测模式：一步法。钩状效应明显，HAMA干扰，灵敏度不理想。化学发光检测模式：一步法。灵敏度好，钩状效应较ELISA为轻，HAMA干扰。,Abbott

18、检测模式：两步法。无钩状效应，灵敏度好，HAMA干扰轻。时间分辨荧光检测模式：两步法。无钩状效应，灵敏度好于ELISA，HAMA干扰。,四、HBeAb方法：竞争法。原材料：1）McAb HBeAb;2）rHBeAg。存在问题：原材料：大肠杆菌表达的基因工程抗原(rHBeAg/E.coli)：优点：稳定性好，使用安全，价格低廉。缺点：特异性差。1、与HBcAg间存在明显的交叉抗原性；2、菌体杂质干扰检测。,HBeAg和HBcAg是基因同源性很高的两种抗原，但具有完全不同的抗体结合表位。由于E.coli在蛋白合成后处理上与肝细胞的差别，rHBeAg/E.coli存在明显的HBcAg免疫反应性。很多

19、人感染过大肠杆菌，血清中的抗大肠杆菌抗体能与重组抗原中的宿主成分结合。,（2）检测模式：由于检测抗原特异性差，不能采用双抗原夹心法、间接法、捕获法等反应模式。,固相载体,HBeAg/E.coli,HBcAb,标记HBeAg/E.coli,Ag/E.coli,抗E.coli抗体,标记Ag/E.coli,夹心法时的假阳性结果,固相载体,HBeAg/E.coli,HBcAb,标记抗人IgG,Ag/E.coli,抗E.coli抗体,标记抗人IgG,间接法时的假阳性结果,解决办法：采用HBeAb McAb为参比抗体，用竞争法检测HBeAb，避免样本中HBcAb及抗大肠杆菌抗体的干扰：,固相载体,HBeA

20、g,HBcAb,标记HBeAb,抗E.coli,Ag/E.coli,阴性结果,HBeAb检测模式：,两步法：1、固相抗体标本中和试剂（rHBeAg）分离游离抗原；2、加入标记抗体分离游离标记抗体，测定固相抗体抗原标记抗体提供的检测信号，判读结果。,经典方法:避免中和试剂抗原和标本中可能存在的HBeAg对标记抗体(HBeAb)的中和作用而引起的假阳性结果。,1）固相-液相竞争法,固相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,HBeAb,标记HBeAb,rHBeAg中和试剂,阴性结果,.,固相-液相竞争法,固相载体,rHBeAg中和试剂,HBeAb（标本）,固相HBeAb,标记HBeAb,阳性结果,2

21、）液相-液相竞争法,一步法：固相抗原标本标记抗体分离游离抗体测定固相抗原标记抗体提供的检测信号，判读结果。优点：操作简便，节约时间。,缺点：当检测标本中存在较高浓度的HBeAg时，可能与液相中与标记抗体结合，封闭标记抗体的抗原结合位点，不能形成固相抗原-标记抗体免疫复合物，导致假阳性结果。,液相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,rHBeAg,HBeAb,标记HBeAb,阳性结果,液相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,rHBeAg,酶标HBeAb,阴性结果,液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg对检测结果的干扰,固相载体,HBeAg(标本）,rHBeAg）,标记HBeAb,

22、液相-液相竞争法竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg对检测结果的干扰,固相载体,HBeAg(标本）,rHBeAg,标记抗体,假阳性结果,3）固相-液相-液相竞争法：,一步法：固相抗体标本中和试剂标记抗体分离游离抗原、抗体测定固相抗体抗原标记抗体提供的检测信号，判读结果。,缺点：除了检测标本中的HBeAg可干扰检测结果，还有液相中的中和试剂rHBeAg的干扰，二者可协同封闭标记抗体的抗原结合位点，导致假阳性结果。rHBeAg与HBeAg的作用相加，对检测的干扰可能比液相-液相竞争法更严重。,.,固相-液相-液相竞争法,固相载体,rHBeAg中和试剂,HBeAb（标本）,固相HBeAb,标记

23、HBeAb,阳性结果,固相-液相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,HBeAb,HBeAb（标本）,标记HBeAb,rHBeAg中和试剂,阳性结果,固相-液相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,HBeAb,标记HBeAb,rHBeAg中和试剂,阴性结果,固相-液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg及中和试剂rHBeAg对检测结果的干扰,固相载体,HBeAb（包被）,HBeAg(标本）,rHBeAg中和试剂,标记抗体,固相-液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg及中和试剂rHBeAg对检测结果的干扰,固相载体,HBeAb（包被）,HBeAg(标本）,rHBeAg中

24、和试剂,标记抗体,假阳性结果,固相-液相竞争法检测HBeAb时，避免了标本中的HBeAg及检测抗原对检测结果的干扰,固相载体,HBeAb（包被）,HBeAg(标本）,rHBeAg中和试剂,标记抗体,阴性结果,HBeAg与HBeAb的临床意义：HBeAg与Dane颗粒、HBV DNA有伴随关系，是HBV DNA复制活跃的血清学指标。HBeAg阳性，说明传染性强。急性肝炎病人血清HBeAg阳性持续三个月以上，说明疾病有慢性化倾向。,HBeAg-HBeAb血清转换(HBeAg 消失anti-HBe 出现)是HBeAg阳性的慢肝病人长期缓解的标志,在慢性乙肝感染期间,HBeAg 的存在与肝脏疾病的活动

25、及进展相关；HBeAg血清转换 与以下相关:HBV DNA下降;ALT 转为正常 临床缓解 组织学上表现炎症活动减轻 HBsAg 血清转换(HBsAg 消失anti-HBs 出现)持久的 HBeAg血清转换(自发的或干扰素诱导)提示有较好的长期预后(生存率和无病存活率）,HBeAg和HBeAb是病情评估、治疗监测、预后估计的重要指标。高浓度HBeAg在一步法检测中会出现假阴性，也会导致液相液相竞争法及固相液相液相竞争法检测HBeAb时的假阳性，二者是有因果关系的两项误差。由于HBsAg/HBeAg阳性与HBsAg/HBeAb阳性两者均是常见的血清学检测模式，上述误差不易引起重视。两种模式所提示

26、的临床意义完全不同。一步法试剂在检测高浓度HBeAg标本时，可能提供了虚假的HBeAg血清转换的病情信息，对临床医生产生了误导。,常见HBeAb检测情况：ELISA检测模式：一步法：1、液相-液相竞争法，2、固相-液相-液相竞争法。如标本中含HBeAg时，明显干扰检测结果，浓度高时易出现假阳性。化学发光检测模式：固相-液相-液相竞争法（改良一步法）。标本中的HBeAg仍将干扰检测结果，但较ELISA轻。HBeAg很高时，也会出现假阳性结果。,Abbott检测模式：固相-液相竞争法(两步法)。避免中和试剂rHBeAg和标本中HBeAg对标记抗体HBeAb的中和作用，也避免了由此引起的假阳性结果。

27、,五、HBcAb方法：竞争法(液相-液相竞争法、固相-液相竞争法)。原材料：1）McAb HBcAb;2）rHBcAg/E.coli。存在问题：1)rHBcAg/E.coli)与HBeAg间存在明显的交叉抗原性，特异性差；2）菌体杂质干扰检测；3）标本中的干扰成分。,由于血清中不存在HBcAg，反应模式的选择对结果影响不大；阳性检出率与标本的稀释倍数关系密切；HBcAg免疫原性强，刺激机体产生HBcAb的时间早，滴度高，持续时间长。有文献报到HBV感染者可表现为HBcAb单项阳性。但一般认为其临床诊断价值不如HBsAg、HBeAg及HBV DNA。,小结：目前乙肝两对半检测结果的准确性普遍不如人意。制备免疫试剂的生物原材料多种多样，是免疫检测的物质基础。试剂生物原材料质量的好坏和检测模式的优劣，决定了检测质量所能达到的水平。影响结果准确性基本的原因：1、检测方法；2、试剂生物原材料的质量。为提高检测结果准确性，应注意各品牌的试剂以上指标的评估。不同的生物原材料和检测模式，各有特点。掌握这些特点，了解其影响检验结果的机理，可以帮助我们客观地分析和评估检测结果，为临床提供正确的诊疗信息，同时也能化解一些检验科的医疗纠纷。警惕常见误差的发生。对可疑结果，认真分析，选用不同试剂、方法进行比对。,谢谢！,