临床基因扩增检验实验室的设置、质量管理.ppt

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1、临床基因扩增检验实验室的设置、质量管理体系的建立及其技术验收,云南省临床检验中心杜廷义2007，12，20,题外话：,不参加实习课？参加实习课？,对相关管理文件的理解：,临床基因扩增检验实验室管理暂行办法临床基因扩增检验实验室基本设置标准（第六条）临床基因扩增检验实验室工作规范（第十条、第十三条、第十四条）临床实验室必须遵循的管理办法及其它行业标准,强调：,污染的控制：预防为主质量保证,污染的途径：,实验材料试剂每一成分设备的每一部位每一操作步骤,污染的判断：,经验：全阳性，CT值35；标准品的CT值发生波动 阴性质控阳性 阳性率异常增高轻微污染和非特异性扩增？,污染和非特异性扩增:,目的基因

2、过程控制,反应体系（引物、模版、酶、镁离子、退火、循环）条件优化,控制的手段：,工作区的严格划分SOP的制订和严格执行去污染措施的常规采用,污染的监测：,阴性质控的设置：阴性血清样本 以水为模拟标本 仅含扩增反应液（加鉴别实验室是否污染的空白管),质控品的位置,标准品空白阳性质控阴性质控临床样本,标准品空白阳性质控临床样本阴性质控,实验室的设置,管理要求：设置标准和工作规范具体落实：实事求是、因地制宜,设置标准和工作规范,“原则上分为四个分隔的工作区；各区必须有明确的标记”“每一区域都须有专用的仪器；不同的工作区应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服；离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出”

3、“，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价”“，本区如采用副压条件或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前区的可能性。,理想的设置,磁性连锁装置,现实的问题是：,建筑结构通道、门水电供应采光、通风,基本的要求:,四个区域必须是相互独立的各区的仪器设备及各种物品必须是专用的各区间不能直通，应有缓冲间，供换工作服及鞋子用产物分析区应安装排风扇或其它抽风装置。,实例：,实例：,实例：,实例：,样本处理区,实例：,小结：,处理原则的核心是通过合理的设置解决好临床PCR检测实际运作动态过程中可能发生的污染的预防问题因此，实验室的设计必须充分考虑到对污染来源和污染途径的预防和控制,实验室各区的功能和配置

4、：,试剂储存和准备区,储存试剂的制备试剂的分装主反应混合液的制备,冰箱混匀器微量加样器可移动紫外灯专用工作服和工作鞋消耗品（带滤心吸头、离心管、一次性手套等）专用办公用品等。,标本制备区：,临床标本的保存 核酸提取、储存及其加入至扩增反应管测定RNA时cDNA的合成不得在本区对样本进行PCR扩增,冰箱(28和-20或-80)高速台式冷冻离心机水浴箱和/或加热模块生物安全柜混匀器微量加样器可移动紫外灯专用工作服和工作鞋专用消耗品专用办公用品等,扩增区：,DNA 或cDNA扩增已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入主反应混合液制备成反应混合液如果空间允许的话，模板的加入也可以在一个独立的空间内完

5、成,核酸扩增仪微量加样器(视情况定)可移动紫外灯专用工作服和工作鞋专用消耗品专用办公用品等,产物分析区：,扩增片段的测定最主要的扩增产物污染来源有可能使用致突变和有毒物质,微量加样器可移动紫外灯专用工作服和工作鞋专用消耗品专用办公用品等,辅助用房：,清洁区标本接受区：灵活设置 不干扰四区 规范的保存和传递,实验室使用和管理：,标本接受区,样本制备区,扩增区,产物分析区,区域的适当合并：,“由于测定技术总是在发展之中，区域的合并应根据仪器的特点而定”,小结：,从核心仪器特点、实验室的现状出发，综合考虑管理要求尽可能在现有条件下满足管理要求以管理措施弥补硬件的不足有条件，留有余地再好的分区设置，如

6、果不辅之与认真执行的相应的管理制度，等同于无。,实验室质量体系的建立：,管理要求体系建立,管理要求：,1 实验室设置和设备1.1 实验室原则上应分为四个区，但如使 用全自动扩增检测仪，区域可适当合 并。1.2 各工作区的明确标记1.3 实验室设置应能有效地防止PCR后区产 物的污染。,管理要求：,2 设施和环境2.1 实验室的设施、工作区域、能源、照明、温控、通风等。应便于检测工作的正常进行。2.2 实验室应配备温度湿度计、稳压电源等。2.3 进入和使用实验室各区域应有明确的限制和 控制。2.4 应有实验室清洁、消毒制度及相应用具；2.5 实验室应有有关生物污染物处理、生物防护 等措施及相应用

7、具；,管理要求：,3 人员3.1 实验室应配备足够数量的人员；这些人 员必须经过培训，并取得上岗证；3.2 实验室应有培训计划和措施，保证其技术 人员得到及时培训。3.3 实验室应保存其技术人员有关资格证书（如上岗证）、培训、技能和经历等技术档案。,管理要求：,4 设备管理4.1 主要设备应有维护程序文件及维护记录；4.2(a)有问题的设备应立即停止使用，并加上明显标识，如可 能应将其贮存在规定的地方直至修复；(b)修复的设备必须 经校准、检定（验证）或检测满足要求后方能再次投入使 用；(c)实验室应检查由于上述缺陷对以前所进行的检测工 作的影响。4.3 加样器、温度计、扩增仪和酶标仪等应有校

8、准程序并进行 校准，扩增仪和酶标仪应有明显的标识表明其校准状态。4.4 应保存扩增仪、酶标仪、生物安全柜、加样器等设备的档 案,管理要求：,5 检测方法5.1 实验室应制定：有关仪器设备操作程 序；有关扩增检测的工作程序。5.2 所有上述标准操作程序都应现行有效并便 于工作人员使用。5.3 实验室应有仪器、试剂、消耗品的选购、验收、贮存和质检程序；必须使用经国 家有关部门批准的试剂和仪器。,管理要求：,6 标本管理6.1 实验室应建立对拟检测标本的唯一编号识别系统。6.2 实验室应制定有关标本收集、处理、运送、贮存 程序。6.3 在接收标本时应有其状态的详细记录。6.4 实验室应确定标本是否符

9、合检测要求,拒收标本 原因要明确。6.5 如果标本必须在特定的环境条件下（如2-8、-20和-70低温）贮存，则应对这些条件加以 维持、监控和记录；,管理要求：,7 记录7.1 实验室应有适合自身实际情况又符合现 行规章制度的记录管理制度；7.2 记录应有参与标本收集、标本准备和处 理、检测的人员签字。7.3 所有记录和报告都应安全贮存、妥善保 管并保密。,管理要求：,8 报告8.1 检测结果的报告应准确、清晰和客观。定性测定报告“阴 性”或“阳性”；定量测定则以拷贝数/ml或IU/ml报告。8.2 每份报告应包括以下信息：（a）标题，例如“检测报告”（b）报告的唯一性标识（如序号）；（c）检

10、测标本的特性 和状态；（d）检测标本的接收时间和进行检测的时间；（f）采用的检测方法；（g）实验操作及校核人员的签字，以及签发日期；（h）检测报告中应给出参考结果或范围；8.3 当报告的有效性发生疑问时，实验室应立即通知临床相关 科室予以改正。8.4 当临床科室或患者要求用电话、图文传真或其它电子和电 磁设备传送结果时，实验室应保证工作人员遵循文件化的 程序，并为对方保密。,管理要求：,9 质量控制9.1 实验室应有室内质量控制标准操作程序 文件：（a）质控物的合理性；（b）质控方法（图）的有效性；（c）失控的判断；（d）失控的措施。9.2 实验室应参加室间质量评价,管理要求：,10 抱怨10

11、.1 实验室应制定抱怨及其处理的标准操作程序；应 将抱怨资料及处理抱怨所采取的措施及结果记录 归档保存。10.2 当抱怨或其它任何事项是对实验室是否符合其现 行程序、或者是否符合临床基因扩增实验室管 理暂行办法和临床基因扩增实验室工作规 范、或是对其它有关实验室校准或检测质量提 出疑问时，则实验室应立即对这些范围的工作和 有关职责进行审核。,管理要求（现场考核）：,送审的文件描述与实验室实际情况的一致性实际运行与文件规定的一致性人员素质：对文件的认知、熟悉、灵活运用程度,现场考核的实际内涵：,认识到不到位落实到不到位符合性检查加指导性检查有重点的全面检查,建立质量管理体系首先要解决的问题：,第

12、一个问题：质量体系建立的核心问题是什么？第二个问题：质量体系模式要达到的管理目的是什么？第三个问题：达到目的的方法（途径、手段）是什么？,质量体系的定义,为实施质量管理所需的组织结构、程序、过程和资源。要点：定义涵盖了实验室管理的每一个 方面。,组织结构：一个组织为行使其职能，按某种方式建立的职责、权限及其相互关系。程序：为进行某项活动所规定的途径。过程：将输入转化为输出的一组彼此相关的资源和活动。,四个组成部分的关系：,关键：核心过程（活动）纽带程序 组织结构 程序 资源 过程,理解,“过程”的重要性 1、工作是通过过程来完成的。2、质量管理是通过对各种过程的控制 来实现的。3、质量管理本身

13、也是一系列的过程过程的分解、控制过程的有机组合,过程,质量体系运行的目的,主要手段：质量体系文件,质量方针：质量手册：阐明实验室的质量方针，各方面质量管理的一般性描述程序性文件：对通用于整个实验室的某些方面工作的文件化描述标准操作程序（SOP文件）：是实验室最为具体、最具有可操作性、也是使用频率最高的文件,PCR实验室技术验收对文件的要求：,仪器设备的维护保养程序；仪器设备的校准程序；仪器设备的操作程序；临床标本的收集程序；临床标本的处理（核酸纯化）程序；临床标本的保存程序；核酸扩增及产物分析检测的操作程序；试剂的质检操作程序；实验室消耗品购买、验收和贮存程序；实验室废弃物的处理程序；实验室的

14、清洁程序；室内质量控制程序；抱怨处理程序。,申请表的附录5“需准备的标准操作程序（最低要求）”对实验室的质量手册和程序文件没作要求对必须具备的SOP文件的编撰格式没作具体要求,SOP：实验室最具个性的文件,不够严谨准确不够连贯不够严密,例：,用加样枪取100l样品加入提取液用加样器（移液器）以前进式移液法吸取100l样品加入提取液,例：,向一新的经高压灭菌处理过的0.5ml离心管中加入10l充分混匀的RNA提取液A（RNA提取液A易沉淀，取样前需用移液器反复吸打混匀后吸取）。加人50l血清标本或阴阳性标准品，再加人200l的RNA提取液B充分混匀。室温放置5分钟。6000rpm离心1分钟，小心

15、吸去上清，用75的预冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀两次。（取75乙醇450l洗沉淀，充分震荡混匀，6000rpm，离心1分钟，然后去上清，再用75的乙醇450l洗一次），65干燥沉淀10分钟。（注：75%乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O）。,机械地抄书、说明书、其它实验室的文件。,撰写SOP文件要做到：,具有专业知识的人，按文件就能顺利完成实验忠实而且连贯地反映实验过程对文件表述的理解无歧义严谨、严密准确和简练,文件的文字组织：简练明确,向一新的经高压灭菌处理过的0.5ml离心管中加入10l充分混匀的RNA提取液A（RNA提取液A易沉淀，取样前需用移液器反复吸打混匀后吸取）。加人5

16、0l血清标本或阴阳性标准品，再加人200l的RNA提取液B充分混匀。室温放置5分钟。6000rpm离心1分钟，小心吸去上清，用75的预冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀两次。（取75乙醇450l洗沉淀，充分震荡混匀，6000rpm，离心1分钟，然后去上清，再用75的乙醇450l洗一次），65干燥沉淀10分钟。（注：75%乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O）。,质量体系文件的构成：,程序文件和SOP的关系,对通用于整个实验室的某些方面工作的文件化描述,具体操作的标准化文件,程序文件等同于以往的管理制度SOP等同于以往的操作卡或操作说明书,WhatWhoWhereWhenWhy,How,写合

17、乎管理要求的，写你做得到的,难点：,写你所做的做你所写的记录你所做的,关键：SOP和记录的必要性和重要性,仪器设备的校准程序,目的：保证检验的有效性，准确性。范围：本程序适用于满足PCR实验室检测需要并可能对检验结果造成误差的仪器设备。主要有：职责：校准由PCR实验室主任负责组织执行。工作流程：4.1 校准方法：Finpipette可调式移液器校准采用厂家推荐方法。校准主要使用设备为BS110S电子天平（Max 110g,d=0.1mg）。4.2 校准计划：4.2.1 启用校准：设备在投入使用时实施启用校准。4.2.2 周期校准：设备在投入使用后，每半年实施一次校准。4.2.3 维修后校准：设

18、备在维修后须经校准方可重新投入使用。4.2.4 校准计划外的校准：如在检测及EQA，IQC活动中发现存在结果漂移或偏差及其它可疑情况时，通 过分析对可疑设备实施校准。4.2.5 Finpipette可调式移液器的校准顺序：按照单一流向规定，对Finpipette可调式移液器的校准首先 校准试剂准备区，然后依次为样本处理区和PCR扩增区。每校准完一个区的移 液器，将其放回原处后，再取下一个区的移液器进行校准。4.2.6 校准安排在不进行样本检测的日期完成。4.3 校准的有效标识：经校准的设备加贴绿色标签，标签上应标明本次校准的日期和结果及下次校准的计划 预定日期。4.4 校准结果的审批及记录保存

19、：每次校准的结果须及时送交科质量负责人审阅签字予以核准。校准记录须 妥善保存直至设备报废。校准涉及的文件：5.1 校准方法文件：Cal-SOP-1 Cal-SOP-25.2 校准记录文件：Cal-Rec-1-112,Finnpipette可调式移液器的校准方法,1 校准原理：采用移液枪吸蒸馏水称重的方法校准；2 校准接受标准：比较测量结果与允许值，若测量结果在允许值范围之外，即使五次 中只出现一次，该支移液器也必须重新校准；3 校准环境和用具要求：3.1 室温：2025，测定中波动范围不大于0.5；3.2 电子天平：在校准前注意检查电子天平的水平状态及校准记录；为保证天平内的 湿度天平内应放置

20、一装有10ml蒸馏水的小烧杯；4 校准操作步骤：按生产厂家推荐的校准步序进行：4.1 按下表指示用量设定移液器移液体积4.2 把芬兰移液器嘴牢固地安装在移液器端部；4.3 用移液器将蒸馏水转移到预称重烧杯中至少五次，并记录重量（读数至十分之一 毫克）若测量结果可接受若测量结果不可接受，使用调较工具进行调试4.5 调试后，重复上述过程，确定该移液器是否已符合要求。5校准注意事项：,Finnpipette可调式移液器的校准记录(Rec-Cal-1),临床PCR检测实验室的技术验收,准备申请：书面资料的提交、审核现场验收：1、设置、设备、档案、记录 等实际情况的检查 2、已知样本现场检测 3、对工作人员的口试或笔试5年后的周期性复审,重塑中国临床基因扩增检验的形象,Merry ChristmasandHappy New Year,