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1、临床基因扩增检验操作规范,浙 江 省 基 因 诊 断 中 心浙江大学医学院附属儿童医院 尚世强,一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求三、PCR污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析,一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能,规范化设置:要求参照临床基因扩增检验实验室管理暂行办法(卫医发2002 10号文)附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。,1.四个隔开的工作区域中每一区域都须有 专用的仪器设备。2.明确的标记,如加样器或试剂等。3.单一方向顺序,从试剂贮存和准备区、标本 制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简 称扩增区)至产物分析区。4
2、.使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。5.实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增 产物分析区的方向进行。6.各自的清洁用具。,各室功能:,(一)试剂贮存和准备区,功能:贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。,含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。戴手套。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面,使用可移动紫外灯(254nm波长)照射,一般照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。,(二)标本制备区,功能:临床标本的保存,核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。,要正确使用加样器。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污
3、染。为避免样本间的交叉污染,加入待测核酸后,必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料,必须有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用于RNA扩增检测的样本制备好以后,应立即进行cDNA合成。,(三)扩增区,功能:DNA或cDNA扩增。,已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中,第二次加样必须在本区内进行。可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。如有加样则应在超净台内进行。打开反应管前快速离心数秒。,(四)扩增产物分析区,功能:扩增片段的测定。,膜上微孔板上探针杂交方法、Southe
4、rn转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质,注意实验人员的安全防护。负压条件。,二、各阶段操作要求,测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。,(一)标本的采集,临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝,因肝素是Taq酶的强抑制剂。玻璃器皿在使用前应高压处理,250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本应尽快(3小
5、时以内)分离血浆,以避免RNA的降解。,(二)标本的稳定化处理,DNA:不需特殊稳定化处理。RNA:异硫氰酸胍盐(GITC)可使 DNA酶和RNA酶失活。,(三)标本的运送,可在常温下通过邮寄运送,如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。未经稳定化处理,则必须速冻后,放在干冰中运送。,(四)标本的贮存,1.血清/血浆等-70 2.用于DNA测定的已纯化核酸样本 43.用于RNA测定的已纯化核酸样本-80 4.用乙醇沉淀的核酸样本-20 5.GITC处理的RNA标本在室温可保存7天,(五)标本的处理(核酸提取),抑制物可能来源于:标本本身(如血红素及
6、其前体或降解产物)。核酸提取过程中残留的有机溶剂(如酚、氯仿等)。痰须液化处理。,操作时(加裂解液后充分混匀,沸水浴)注意:离心管不能插得过低,以防进水;水浴时不能加盖,防管盖爆开;水浴时间须准确,101 min;水浴时不能走开;左右手分开,左手只接触样本,右手只接触加样器及操作仪器。,(六)靶核酸的逆转录(RT)和扩增,有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性结果,如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg+浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。,RT-PCR操作注意:,标本必须新鲜;做RNA标本的枪头离心管必须无菌;冰上操作;处理完后须立即上机,不能
7、放置;注意左右手分开。,(七)扩增产物的分析,扩增产物的测定有各种方法,如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。,实时荧光定量PCR,在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程,最后通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量PCR使用荧光强度定量不同,实时荧光PCR一般使用Ct(每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数)定量,Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系。实时荧光PCR的优点:精密度高,重复性能好。,TaqMan荧光定量PCR原理,探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记,因为距离相近,基团相互作用,不产生荧光;探针与模板杂交在引物区间内,当扩增进行时,Taq DNA聚合
8、酶的5-3外切酶活性降解探针,荧光基团和淬灭基团分开,受激产生荧光信号;荧光信号强度与扩增产物量成正比;,三、PCR污染与对策,PCR污染分环境污染与反应液污染二种。常见PCR污染源有三个:第一、标本间的交叉污染;第二、实验室中克隆质粒的污染;第三、PCR产物的污染(Carryover)。,要防止PCR污染,必须做好以下3个环节的工作:(一)污染的预防(二)污染源的追踪(三)污染源的处理,(一)污染的预防,操作PCR时,按照下述规则可有效地预防PCR的污染。1、PCR的前处理及后处理要在不同的隔 离工作台上或房间内进行。2、分装试剂,标记批号,3、改进实验操作:(1)带一次性手套;(2)避免反
9、应液的飞溅;(3)用一次性移液器或吸头,吸头不要暴露于 空气,以免产物气溶胶污染;(4)操作多份样品时,要先将可混匀的成分(dNTPs,缓冲液,引物等)一起制备标准 混合液(Master mix);(5)制备反应混合液时,最后加入样品DNA,加入DNA后,在进行下一步操作前要盖紧 反应管。4、检查结果的可重复性。,(二)污染源的追踪,1、阳、阴性对照,选择阳性对照时,应选择扩增弱,且重复性好 的样品。阴性对照的选择一定要小心。不含模板DNA的PCR试剂对照。,2、常见的环境污染源有,(1)点杂交的点样器;(2)切片机;(3)离心机;(4)切胶用刀或微解剖刀;(5)浓缩用具,真空瓶;(6)电泳装
10、置和紫外灯箱;(7)干冰/乙醇或水溶锅;(8)冰箱门把手、冷冻架和门把手。,追踪可疑的环境污染源,用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分 在0.1ml 去离子水中浸泡;取5l 作PCR反应;电泳检查结果。,(三)污染源的处理,1.环境污染处理法,(1)稀酸处理法。对擦试实验阳性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡残留DNA。(2)紫外法:UV照射波长一般选择254/300nm,需考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布。UV对长片段(500bp以上)有效,而对短片段效果不大。,2.反应液的污染处理法,(1)DNaseI法:PCR混合液(不加模板和Taq酶)中加入0.5U DNaseI,室温
11、下作用30min后,加热灭活,加入模板和Taq酶后即可进行正常PCR。优点:便宜,不需知道扩增DNA序列。,(2)内切酶法:选择识别四个碱基的内切酶(如MspI等),最好几种合用,可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上,只是DnaseI由内切酶(MspI10U)代替,作用时间延长到1.01.5h。(3)紫外照射法:反应中不加模板与Taq酶。,(4)尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)法:dUTP代替反应中的dTTP,使产物中含大量dU,UNG可去除dU,使失去dU的位置,阻止Taq酶的延伸。PCR正常循环前,用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物的污染,而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活,
12、所以,对含dU的新合成PCR产物没有影响。,T A T A T A T A T A PCR A U A U A U UNG A A A 加热 A A A PCR,该法优点:去除任河来源(包括引物在内)的 污染;由于污染的产物有大量dU存在,因此,UNG处理会彻底消除污染。UNG处理与PCR扩增可在同一试管 内进行。,四、因操作欠规范导致的问题分析,(一)实验室仪器设备,1、设备不齐全、不配套,使得实验结果不稳定,引起假性结果。旋涡混合器,微量加样器,正规的紫外透射仪。RNA PCR样品处理时,血清(或血浆)中加入强 烈变性剂后,血样中的蛋白变性、结块。吸头与微量加样器不配套。2、PCR热循环仪
13、的差异或质量问题。,移液器:,严禁大力来回拧动;严禁调至容量之外使用;第二档为排空档,不得作吸取之用;吸头应浸入液面23mm处吸取;严禁将有液体的移液器平放或倒置;混匀沉淀时,将吸头紧贴于沉淀上方管壁,反复吸取液体,将沉淀反复混匀,溶解;每周用75%乙醇清洗一次,若有污染随时清洗。,离心机:,离心前,离心管须配平;将调速档打至0档位,才能打开电源开关,逐渐升高转速,直至即定转速;定时旋钮不能强行归零;转头未停止时,严禁打开盖板。,(二)实验室布局不合理引起的污染问题,1、样品处理不进行隔离,样品中各种核酸片 段均会通过空气进行传播。2、PCR结果检测实验室和其它实验室在一 起,会出现严重的扩增
14、子污染。3、仪器设备及工作服等(尤其是加样器)公 用,也会造成严重污染。4、实验室操作垃圾(吸头、离心管、样品杯 等)乱 放,飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室 污染。,(三)PCR操作中存在问题分析,1.阳性变阴性2.阴性变阳性3.PCR结果不稳定,1.阳性变阴性,(1)有些阳性病人,经过PCR检测后为阴性,可能有两种情况:一是采集标本方法或部位不正确,二是如果病人取样部位病原体消失,需根据病人的病理情况采样。,(2)标本保存不当,可引起PCR失败。收集的标本乱放(未放冰箱),病原体的破裂,检测的核酸降解,失去了PCR检测的模板或造成标本污染。,2.阴性变阳性 常见的原 因有以下
15、6点:,加入试剂或样品时引起的交叉污染(最好在加完所有其他反应成分,包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA,将模板加入微量离心管后,盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管侧壁,以摇匀液体,再作瞬时离心10秒,使水相和有机相分开)。,加样器通道易形成气溶胶,造成加样器通道污染,可通过使用有滤筛的吸头避免污染(将模板DNA加入PCR系统时,注意切勿形成喷雾,后者有可能污染别的反应,所有并非即用管都应盖严)。,打开标本管盖引起样品飞溅(打开前须瞬间离心)操作时手套引起的交叉污染(拿过模板DNA管后应更换手套),不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染(必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他
16、成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加)。实验室污染,3.PCR检测结果不稳定(1)样品处理方法不当,标本中杂质很多,血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。蛋白质DNA电泳带拖尾 血红素中的卟啉化合物抑制Taq酶活性 代谢产物干扰引物配对,(2)操作不当带来的后果 主要指不能严格按照说明进行操作造成PCR检测失败。如HCV RNA PCR样品处理试剂A、B、C和75%乙醇的操作过程。,50l血清标本(标本可用血清或血浆,尽量避免使用肝素做抗凝剂,避免反复冻融)加200l试剂A后立即混匀(试剂A是强烈的变性剂,不仅要将病毒外壳变性裂解,释放 核酸,而且要将样品中包含的其
17、它蛋白(包括RNase)变性,以避免蛋白进入PCR反应体系(RNase降解RNA模板),干 扰PCR扩增;混匀这一步至关重要,一定要振荡混合均匀才 能达到充分变性的结果。)加入试剂B(氯仿、异戊醇)50l混匀(抽取变性剂及变性的蛋白,分离出核酸,同样必须充分 混匀,否则也会引起PCR检测失败),14 000r/min离心5min取上清80100l(取上清一定要小心,不能抽取中间蛋白沉淀层,否则 因核酸沉淀中含有变性蛋白,引起PCR检测失败)加等体积试剂C14 000r/min离心10min,弃上清(将核酸从水溶液中沉淀浓缩)用75%乙醇洗一次(除去与核酸共沉淀的盐及杂质)干燥备用(干燥后,切勿将管子倒置或掉落,防止沉淀飞出管底),在痰标本处理时液化是十分重要的,痰没有彻底液化,病原体不能完全释放出来;反之液化过度会使病原体裂解,导致PCR检测失败。总之,样品处理对PCR检测是至关重要的,是导致PCR检测失败的最常见原因之一。,谢谢,
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