中药显微鉴别技术讲义.ppt
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1、第三部分 显微制片技术,在进行显微鉴别时,首先要将“检样”制成适于镜检的标本。对于完整的药材可制成各种切面的切片;对于粉末药材(包括丸、散等成方)可直接装片或作适当处理后制片。永久片制作技术 临时制片技术,1、制片设备滑走切片机半自动切片机,脱水机 包埋机,2 变倍体视显微镜,是一种具有立体感觉的显微镜。主要用途:作为动物学、植物学、昆虫学、组织学、矿物学、考古学、地质学和皮肤病学等的研究和解剖工具。,电脑型连续变倍体视显微镜,SZX-16研究用,电脑(数码相机)型连续变倍体视显微镜,它观察物体时能产生正立的三维空间像,立体感强,成像清晰和宽阔,具有较长的工作距离,并可根据观察物的特点选用不同
2、的反射和透射光照明,是适用范围非常广泛的常规显微镜。对同一物体可实现连续放大倍率观看,可能直接电视机或电脑上观察实物图像。,目镜镜臂物镜转换器物镜玻片移动装置载物台聚光镜光源镜座,3、透射光生物学显微镜,数码型透射光生物学显微镜,4、偏光显微镜,偏光显微镜,偏光显微镜(polarizing microscope),用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏振器),使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中装有另一偏振片(检偏振器,一个偏振方向与起偏振器垂直的起偏器),这种显微镜的载物台是可以旋转的,当载物台上放入单折射的物质时,无论如何旋
3、转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折射性物质时,由于光线通过这类物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种物体。,在偏光显微镜下,药材的鉴别要素在色彩上表现出一定的变化,可作为大多数植物、动物、矿物类药材的显微鉴别 依据之一。如植物的淀粉在偏光显微镜下呈现黑十字现象,不同类型的淀粉其黑十字形象不同(图2);草酸钙结晶类型多样,在偏光显微镜下呈不同的多彩颜色(图2);石细胞在植物体内广泛分布,其细胞壁在偏光显微镜下呈亮黄色或亮橙黄色;纤维、导管在偏光显微镜下则呈强弱不同的色彩;动物的骨碎片、肌纤维、结晶状物、毛茸等也呈现出不同的偏光特性;矿物类物质多具有偏光特性。,
4、偏光下的草酸钙晶体与淀粉粒,5、倒置生物学显微镜,6、扫描电子显微镜,扫描电镜工作原理,扫描电子显微镜(简称扫描电镜),分辨率高,放大倍率5100,000,能使物质的图像呈现显著的表面立体结构特征,样品制备操作又较简易。在药材鉴定,特别在同科属种间的表面结构的鉴别比较上,已成为一种新的手段。如:扫描电子显微镜用于研究花粉粒、种皮和果皮的表面纹饰,茎、叶表皮组织的结构(毛茸、腺体、气孔、角质层、蜡层、分泌物等)的细微特征,木类药材的解剖以及动物体壁、鳞片及毛等的鉴别。,小孢子囊及小孢子微形态差异,十三种卷柏大孢子微形态差异,使用显微镜的注意事项,合理制片,盖玻片上不得有试液残留,避免污染物镜及载
5、物台,损伤镜头。转动物镜转换器,由低到高逐级变换、选用合适放大倍数的物镜观察。使用40倍物镜时,可用细螺旋调节焦距,禁止用粗螺旋调节;也不得移动载玻片。根据观察物象,选择偏光条件确认特征。用毕,应将最小物镜与通光孔相对,关闭光源,罩好,收置起来。显微镜的光学部分,只能用特殊的擦镜头纸擦拭。,7、常用制片法 永久片制作技术,药材切片标本的制作方法较多。在药材鉴定的研究工作中往往将其制成石蜡切片(永久切片),因制成的石蜡切片外形较完整,厚薄均匀,且可制得连续切片,观察时方便,又能长期保存。但由于制片技术较复杂,费时太多,不适用于日常检验。,常用制片法 临时制片技术,徒手切片或滑走切片法:表面装片:
6、为观察叶类、花类及全草类药材的叶片、花冠、萼片、苞片等的表皮组织及其附属物的特征。解离组织装片:可清楚地观察比较坚硬的细胞组织,如导管、纤维、石细胞等的形态。花粉粒与孢子制片法:观察花粉粒、孢子等的形态特征或构造,需用花粉粒与孢子制片法制片。磨片法:观察矿物药或较坚硬的动物类药材如珍珠、石决明及动物骨骼,可采用磨片法制片。,7.1 仪器和用具,仪器 生物学显微镜(最好具有2.5或4物镜头及偏光装置)、显微摄影装置或显微描绘器、电脑联机装置及其图像处理软件、滑走切片机、小型粉碎机、台式离心机、医用超声仪等。用具 放大镜、刀片、镊子、剪刀、解剖针 载玻片、盖玻片,7.1 仪器和用具,吸湿器(即玻璃
7、干燥器改装成底部放入蒸馏水加微量苯酚防霉,上部瓷板上置药材样品,利用潮气润湿药材样品)培养皿或小烧杯、酒精灯、试管,试管架、滴管、玻璃棒、乳钵、绸布、滤纸、火柴等。,7.2 试液封藏剂,水合氯醛试液 为常用封藏液,也是透化剂。可使干缩的细胞膨胀而透明,并能溶解淀粉粒、树脂、蛋白质、叶绿素及挥发油等,加热后更为明显。甘油醋酸试液(斯氏液)为常用封藏液,专用于观察淀粉形态,可使淀粉粒保持原形,便于测量其大小。甘油-乙醇溶液 封藏液,也是软化剂。常用于保存植物性材料及临时切片,有软化组织的作用。,3 试液染色剂,苏丹试液 此液可使木栓化、角质化细胞壁及脂肪油、挥发油、树脂等染成红色或淡红色。钌红试液
8、(临用新制)此液可使粘液染成红色。间苯三酚试液 此液与浓盐酸合用,可使木化细胞壁染成红色或紫红色。碘试液(临用现配。应置棕色瓶内保存)此液可使淀粉染成蓝色或紫色;蛋白质或糊粉粒染成棕色或黄棕色。,7.2.8 硝铬酸试液 此液为常用的“植物组织解离液”。各检品的解离浸泡时间,按材料的质地不同而异。7.2.9-萘酚试液 此液可使菊糖染成紫红色,并很快溶解。3.1l 氯化锌碘试液 此液用于检查木质化与纤维素细胞壁,前者显黄棕色,后者显蓝色或紫色。,7.3 显微标本的制作,横切制片或纵切制片 药材的预处理 将应观察的部位、切成适当大小的块或段,一般以宽lcm、长3cm为宜,切面削平整。质地软硬适中的样
9、品可直接进行切片;质地坚硬的则需先使其软化后再切片。,制片的预处理软化,软化方法可采用放在吸湿器中闷润,或在水中浸软或煮软。经软化处理的材料,检查软化是否合适,可用刀片切割材料,若较容易切下薄片,则表示软化适宜。有些根、根茎、茎及木类药材,质地较坚实,可将削平的切面浸水中片刻,待表面润湿时取出,直接切片也能切成较完整的薄片。过于柔软的样品,可将其浸入70%95%乙醇中,约20分钟后可变硬些,再切片。,制片的预处理禁忌,药材预处理时,应注意不能影响要观察的显微鉴别特征。如要观察菊糖、粘液等在软化、切片、装片等过程中,均不可与水接触,以免溶解消失;要观察挥发油、树脂等,则不可与高浓度乙醇或其它有机
10、溶媒接触。如:茯苓 淀粉粒 菊糖,7.3.1.2 切片,在检验工作中,此法最常用,操作简便,迅速,制成的切片保持其细胞内含物的固有形态,便于进行各种显微化学反应观察,1)徒手切片法切片,一手持刀片,另一手拇指和食指夹持样品,中指托着样品的底部,使样品略高出食、拇二指;肘关节应固定,使样品的切面保持水平,刀口向内并使刀刃自前向后切削,即可得薄切片。操作时,材料的切面和刀刃须经常加水或50%乙醇保持湿润,防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛笔蘸水轻轻从刀片上推入盛有水或50乙醇的培养皿中。,2)滑走切片机切片,此法不需要较高的技巧,只要了解掌握操作方法,短时间内即可学会并切出较薄的切片,适用于切质地
11、坚实、形状较大的药材样品,柔软的样品经冷冻处理亦可切得较薄的切片。,切片前:,应检查切片机是否稳固,并调试刀具。将切片刀夹持在夹刀器上夹紧,调整刀的角度(约0。15。);调整厚度调节器至所需厚度。把制备好的样品用两块软木夹住或直接放在切片机的材料固定器上夹紧夹正,使样品露出软木块或固定器上端0.5cm,调整好样品高度,使刀刃靠近样品的切面且平行并略高于刀刃约0.51mm。,切片时,用右手握夹刀器柄,往操作者方向迅速拉动,切下的切片附着于刀的表面上,用毛笔蘸水把切片取下放于盛水的培养皿中。将刀推回原处,转动厚度推进器,用毛笔蘸水润湿材料切面及刀刃,再拉刀柄,往返推拉,可得到许多厚度均匀完整的切片
12、。若切片不成功,应检查切片刀是否太钝,则应磨刀或换锋锐的切片刀,若切得太薄而破碎,则逐渐增加厚度至能切得完整的薄片为度。注意:夹持在材料固定器上的样品切面接近于固定器上端时,必须注意防止切片刀刃碰撞固定器而损毁切片刀。,装片,选取薄而平整的切片置载玻片上,根据所要观察的内容要求,滴加适宜的试液12滴,盖好盖玻片,即可在显微镜下观察。为防止较大的切片弯卷,可选取理想的切片,用两张载玻片夹住,浸于水中放置4小时使材料压平,放入95%乙醇中固定,甘油装片观察。,透化,在载玻片上放有切片处滴加12滴水合氯醛试液,置载玻片于酒精灯上方微微加热,至边缘起小泡即停止加热,可继续补充试液再加热,以不烧干为度,
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