中药指纹图谱的原理与应.ppt

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1、中药指纹图谱的原理与应用,2001级 药学院李勇 沈全妃 沈林强 朱建波 乔洪翔 方亮 江周虹,中药指纹图谱，即中药身份证，主要指中药化学指纹图谱，实际上是一种保证中药质量的措施，是指对某种中药材或中成药等运用现代分离分析科学的手段，得到能够标示该中药的色谱或光谱的图谱，最终用来对中药质量评价的科学性方式。它有两个显著特点，一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地。二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。,中药指纹图谱借用DNA指纹图谱发展而来，最先发展起来的是中药色谱指纹图谱。中药色谱指纹图谱是一种综合的，可量化的色谱鉴定手段2

2、。借以鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。,中药指纹图谱按应用对象分类，根据中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程的各个阶段，可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。如分得更细，还可包括用于工艺生产过程中间产物的指纹图谱。两种中药原料药指纹图谱应区别对待。对中药饮片指纹图谱的要求基本和中药材指纹图谱相同。对中药配伍颗粒(包括标准提取物)指纹图谱应要求高一点。,中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱系指采用光谱、色谱和其他分析方

3、法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。光谱最常用的是红外光谱(IR)。色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。其他方法包括波谱和联用技术。中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用技术。TLC法简便易行，但提供信息量有限，很难反映几十种、上百种化学成分组成的复杂体系。GC适用于挥发性化学成分。HPLC适用于非挥发性成分，中药中大部分化学成分均可用HPLC法得出良好的指纹图谱。CE适用于大部分化学成分，特别是生物大分子肽和蛋白的分离，但其重现性有待提高。,联用技术是最有效的建立指纹图谱的方法，如GC/MS，HPLC/MS，HPLC/MS/

4、MS等可大量提供各种信息，符合解决中药复杂体系的要求，但仪器价格昂贵。不易推广使用。总之，目前使用最多的中药化学指纹图谱是用HPLC方法。中药生物指纹图谱包括中药材DNA指纹图谱和研究中的中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱。中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药制剂作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这2种指纹图谱似可称为生物活性指纹图谱。目前而言，最主要和常用的是中药化学指纹图谱，特别是中药HPLC指纹图谱。,下面，对各种指纹图谱分门别类加以介绍。,薄层色谱(TLC)由于操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑澜的彩色图像，直观易

5、辨，在中药鉴别中应用频率最高。采用合格材料和标准操作，可得到高质量的色谱图像，于同板同时比较鉴别多个样品，配合数码成像和数据处理，还可瞬间形成轮廓图谱，并给出各峰积分值，加大信息量，从而提高综合分析能力，比较适合原料药材指纹图像分析。由于薄层色谱法是一种开放系统，外界影响因素较多，必然会增加实验的难度。,气相色谱(GC)以气体为流动相，对于含挥发性成分中药的鉴别具有一定优势。由于裂解气相色谱具有操作简便、样品无须化学前处理、提供信息量大等优点而格外引人注目。该方法将样品故人裂解器内，在一定的条件下将样品加热使其瞬间裂解，生成可挥发性的小分子物质，立即被载气带人气相色谱系统的分析柱上，分离后得到

6、具有指纹性质的裂解气相色谱图。如果将气相色谱与质谱、傅立叶变换红外光谱联用，则不但可以知道不同中药中挥发性成分的差别，而且可以对这些成分进行鉴定。,高效液相色谱(HPLC)具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、方法重现性好、选择性高、适用的样品类型广泛等特点。已经普遍应用于中药材及制剂的分析检测，特别是三维高效液相色谱法，近年来发展很快，非常适合构建中药指纹图谱。与薄层色谱相比，它是封闭系统色谱，受外界影响小，色谱稳定性、重现性好，其分离、鉴别能力远远高于薄层色谱。在中药指纹图谱中首推高效液相色谱指纹图谱。HPLC所分析的中药中，有相当部分为次生代谢产物，而这些产物的组成和含量不仅和药材本身的

7、种属有关，同时还与植物后天所处的地域环境、生长条件、采摘时间和炮制方法有很大的关系。对于中成药来说，与产品的加工过程也有很大的联系。不同的加工过程与方法都将对所得的指纹图谱有相当影响，表现在峰高、峰面积、保留时间以及峰数量上的变化等。因此，HPLC不仅可以用来对生药的真伪、优劣进行鉴定，同时还可以对中药的加工过程进行监测，可以有效地分析鉴定经过不同的炮制、加工的中成药。,高速逆流色谱指纹图谱(HSCCC fingerprintspectrum，即调整逆流色谱法)HSCCC利用动态液-液分配原理分离样品，其分离度和重现性与HPLC类似，但样品前处理简单。具体地说它是一种基于液-液多级逆流萃取建立

8、的色谱体系，以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作分离柱，在行星式运动中连续地完成整个分配、传递、分离过程；无固相载体，避免了待分离样品与固相载体表面发生化学反应而变成不可逆吸附；分辨率高，可分离纯品；可采用正向或反向的连续洗脱、步级洗脱、梯度洗脱等方式；可采用多种多样的溶剂系统实现物质的对流分配；能在一个流程中分离复杂样品中极性差异极大的各个组分，特别是能有效地分离强极性的组分；仪器及试剂成本明显低于高效液相色谱，适用于制备高纯度、高附加值的化合物。,超临界流体色谱法(SFC)以超临界流体作流动相，它通过控制压力调节流动相的密度实现对溶解度的调节，从而使不同物质分别进行溶解与分离。超临界流体溶解能力强，

9、流动性好，传质速率快，融合了HPLC和GC的优点而部分地避免了它们的缺点。SFC比GC应用范围更广，比HPLC定量效果更好，分离的时间更短，样品的前处理更简单，更易与大型分析仪如质谱仪、傅里叶变换红外光谱仪和核磁共振谱仪等联用。SFC适用范围很广，理论上，能够用HPLC分离和测定的化合物，都可以用SFC来分离和测定，某些用HPLC不能分离的物质用SFC也能得到较好的效果。,近10多年来发展很快的高效毛细管电泳技术(HPCE)是一种高效分离分析技术，以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现分离。具有灵敏度高、柱效高、分析速度快、所需样品量少、溶剂消耗少和抗

10、污染能力强等优点。不仅适用于小分子酸、碱、盐及中性分子和生物大分子如核酸、多肽、蛋白质等的分析，在中药有效成分分析方面也显示出一定优势。,中药紫外光谱(UV)特征的差异，在定程度上反映了中药化学成分的差异。某些情况下，伪品虽可在外观上以假乱真，但其化学成分的组成和含量与正品必有差异，这种差异在紫外光谱上必有所反映。如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别，可采用多阶导数光谱法提高分辨率。,红外光谱(IR)一直是药品鉴定的权威方法，但这是对纯物质而言的。中药提取液是复杂的混合物体系，这一混合物的红外光谱在本质上与纯化合物的红外光谱不同，它是混合物中各组分红外光谱的叠加。中药各种化学成分只要质和量相对稳

11、定，并且样品的处理方法按统一要求进行，则其红外光谱应是相对稳定的。这样得到的混合物红外光谱应该具有一定的客观性和可重复性。据此原理，不必将混合物红外光谱各主要吸收峰进行归属，只要在4000400cm-1范围内比较光谱的差异即可。应该指出，紫外和红外光谱都具有加和性，对于混合物来说，其鉴别专属性差，分辨率低。需借助计算机模式识别技术或模糊数学方法进行处理。,三维荧光光谱指纹技术是研究样本的三维荧光指纹特征，建立起对照品的三维荧光指纹图谱，而不同的药物具有各自特征的指纹图类型和特征指纹，药物的荧光强度与其含量成正相关关系。因此，荧光强度可作为药物含量评估的依据之一。三维荧光光谱技术比常规荧光分析方

12、法更能反映激发波长和发射波长同时变化时的荧光强度信息，而且具有灵敏度高、选择性好等优点。,核磁共振波谱(NMR)是鉴定有机化合物结构的常规方法和重要手段。植物中药特征性化学成分往往不限一种，多表现为特征性成分组。因此，其特征性标准提取物的NMR谱是其中各种成分图谱的叠加。在混合物的NMR图谱上，除每个信号在磁场中的共振数据外，信号的相对强弱反映了混合物中各组分的相对含量。当图谱不太复杂时，也可观察到某些信号的偶合关系。通过对各化合物进行结构鉴定和NMR研究，可实现植物中药NMR指纹图谱的解析。,传统的质谱技术无法测定大分子(分子量超过2000Da)、极性分子和难汽化分子的结构。电喷雾电离(el

13、ectrospray ionization，ESI)和基质辅助的激光解吸电离(matrix assisted laser desorption ionization，MALDI)等软电离技术使简便、快速、准确地研究生物大分子成为可能。目前质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质和核酸的核心技术之一。将中药提取物置于质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取物中化学成分的EI-MS图。不同中药提取物所含成分不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步的裂解碎片峰亦不一致，可用于鉴别。MS法灵敏度及准确度高，指纹特征性强，常与HPLC、GC联用。液相色谱可以起到脱盐和浓缩样品的作用，减少盐或其它小分子对样品离

14、子化的影响而降低样品的损耗和污染。液相色谱与质谱在线联用使质谱法与常规的蛋白质分析方法可以很好的联用，其精确度和灵敏度都大大超过了常规方法。并且，快速流动的在线分离技术是一种高效率的生物分析方法。用LC/ESI/MS进行生物大分子的分析鉴定能获得满意的结果。,X射线衍射法(XRD)是研究物质的物相和晶体结构的主要方法。当对某一物质进行衍射分析时，该物质被射线照射而产生不同程度的衍射现象。物质的组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱。如果是混合物，则所得衍射图是各组成成分衍射效应的叠加。只要混合物的组成是恒定的，衍射图就可作为混合物的特征谱。衍射法所获得的信息量大，

15、指纹性强，稳定可靠，是中药定性鉴别的可靠依据。另外，该方法所需样品量小，不破坏样品，操作简单。,现代分子生物学研究发现，核苷酸序列含有生命有机物构建、维持和繁殖生命所必需的遗传信息，不同种生物体含有不同的DNA序列，同种生物体既有相同的DNA序列，保持同种生物体的遗传性状，又具有多态性，使同种生物各个体千差万别。由于这种核苷酸序列是相对稳定的，因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图。其原理是：每个生物体个体的DNA经酶切后，电泳分离，用标记的DNA探针杂交和放射自显影后形成的带纹分布应该是有区别的，具有个体、群体和物种的特异性(DNA fingerprintion，DNAfp)。如要了

16、解中药复方制剂中的某味药是否存在，通过对这种中药材的分子遗传标记的研究，找到具有该种高度特异性的片段，便可以此为基础，制备出对该种高度特异性的寡核苷酸探针，再经分子杂交进行指纹分析，即可达到鉴别目的。DNA指纹图具有高度的个体特异性。DNA指纹图谱技术包括AP-PCR(arbitrary primer PCR，任意引物聚合酶链式反应)和RAPD(随机扩增多态性DNA，randomly amplified polymorphic DNA)两种指纹图谱技术。RFLP(限制性内切酶片段长度多态性，restriction fragment length polymorphism)是最常用的构建DNA指

17、纹图的方法，但该法费时费力，使应用受到限制。随机扩增多态DNA(RAPD)标记，可以在特异DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。此外，还有SSR(简单重复序列，simple sequence repeat)、ISSR(简单重复序列间区，inter simple sequence repeat)、AFLP(扩增片段长度多态性，amplified fragment length polymorphism)及小卫星等。,多维多息特征谱即联用技术将色谱法良好的分离能力与波谱法特有的结构鉴别能力相结合。所谓多维是指采用多种分析仪器联用的模式，所

18、谓多息是指中药的特征谱应包括化学和药效两方面的信息。单一的分析方法难以反映中药的复杂性，近年来采用多种现代分析仪器联用方式得到的多维多息特征谱的应用在增加，已成为非常有效的分离、鉴定手段。例如：GC/MS、LC/MS、HPLC/MS、HPLC/NMR、CE/MS等联用技术为中药指纹图谱的研究应用提供大量的信息。目前最常用的是高效液相色谱(或毛细管电泳)二极管阵列检测器质谱质谱联用方式(HPLC或CE/DAD/MS/MS)得到的指纹图谱。如利用液质技术对样品进行指纹图谱的确定，应用质谱中质荷比(M/Z)值及HPLC图峰响应比值比较两者差异；利用LC-MS联用技术对样品组分进行多维多息化学特征谱的指认，通过质谱中质荷比(M/Z)值及HPLC中的峰保留时间的相互对照，主要成分进行归属。,关于中药指纹图谱的实际应用，举例如下用于鉴别药材的真伪、易混淆品种 用于控制成药的质量 用于研究稳定性 用于临床研究用“新药”的质量控制和监督,中药指纹图谱测定、解析方法与实际应用目前仍在不断地探索与开发之中，这是一个长期的探索过程。,Thank you!,