实验六SDS实验报告.docx

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1、实验六SDS-PAGE测定蛋白质分子量生物111 杨明轩1102040128一、研究背景及目的对于那些生物体内含量高、易于分离结晶获得纯品的蛋白，可以通过测定氨基酸序列，借助各种氨 基酸的分子量求出蛋白的分子量，并与质谱等手段相互结合，得到精确可信的分子量。但对于那些含量 少，不易分离的蛋白，无法实现结晶，就必须借助其他手段测定其分子量。要找到能够测定分子量的实验手段，首先要考虑那些能够将不同分子按照其各自的分子量分离的技 术。在众多的技术当中，密度梯度离心、层析、电泳都与物质的分子量有关。其中，超速离心机造价高， 使用过滤层析色谱测分子量要做标准曲线，柱长要求高，且这些方法不够准确。因此，电

2、泳技术成为了 实现分子量测定这一目的的最佳选择。但是，在活性电泳中，影响蛋白前迁移率的因素有蛋白质的电荷性质、分子大小和形状。要测定分 子量，就要消除电荷、分子形状对蛋白迁移率的影响，即使得各种蛋白的电荷、形状不存在显著差异。 对于电荷，使各分子不带电违背电泳的基本原理，而使各分子带点完全相同是无法实现的，因此考虑使 其带上大量电荷，从而让分子之间的电荷差异可以忽略。在活性电泳中，改变样品的带电情况依靠的是 缓冲液pH的变化，显然不能够使分子大量带电，这就表明必须向电泳体系中引入其他物质，与蛋白分 子定量等量结合，且不改变分子量差异造成泳动差异。对于分子形状，考虑到功能性蛋白大多是球形粒 子，

3、要保持形状不变，就要实现对蛋白的包裹性结合。而蛋白表面的电荷分布情况千差万别，依靠电荷 性质无法结合形成稳定的复合物。考虑到蛋白质中含有大量的疏水氨基酸，可以通过疏水作用结合，这 就要造成蛋白变性，是疏水基团充分暴露出来，分子不能在维持球型而变成棒状，因此，所选择的物质 还需要能够维持复合物形状的统一。基于以上考虑，科学家选择了双亲性物质，既能通过疏水作用与蛋 白定量结合成牢固的复合物，又能借助亲水性在溶液中良好分散。新技术的发明常以原有技术作为基础。在活性电泳中，采用碱性体系，依靠浓缩效应实现了样品的 浓缩，大大提高了分析的精度。而变性电泳属于全蛋白染色，结果较准确。在变性电泳中，要借助浓缩

4、 效应，就要使样品由负极向正极迁移，那么所选择的物质与蛋白结合之后要形成带负电的复合物。就这 样，选择了十二烷基硫酸钠（SDS）作为变性剂。而旦，发现形成的复合物成棒状，短轴恒定，而长轴与 分子量相关。所以，SDS就成为了理想的变性剂。这种方法最适宜测定分子量是15,000-100,000的样品, 对低于10,000分子量的水解蛋白不太适用。通过改进，用强电解质离子为前导离子和拖尾离子可对分子 量低于10, 000的水解蛋白样品进行分子量测定。用这种方法测定蛋白质的分子量，分辨率高，所需设备 廉价，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在10%以内，因而其广泛应用于蛋白分离纯化和分 子量测定。

5、因此，SDS-PAGE是目前常用的测定蛋白质分子量的方法。本实验通过利用SDS-PAGE测定实验四纯 化的麦清蛋白，学习和掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理，掌握其具体操作：并与活性电泳进行对 比，了解其异同，加深对电泳技术了理解。二、实验原理1、聚丙烯酰胺凝胶电泳可对蛋白质的种类和数量做定性分析，带电蛋白质分子在电场作用下将作定 向移动，在其他条件（电场、介质粘度等）不变的情况下，蛋白质在凝胶中的迁移速率受分子所带净电荷 量与分子大小、形状等因素的影响。如果两种不同分子量的蛋白质的分子大小的差异被所带净电荷量的 差异所补偿时，则这两种不同分子量的蛋白质可以相同的速率电泳，无法通过电泳

6、距离测定蛋白质的分子 量。因而要测定分子量则需要蛋白质以分子量为唯一变量进行泳动，即需要引入某种物质与蛋白结合消 除净电荷和分子形状的影响。由于变性电泳由活性电泳发展而来，浓缩效应是在碱性体系下建立的，在此体系下蛋白质带负电， 又由于蛋白质的等电点普遍低于7,在碱性体系下不同蛋白质所带电荷量不同，自身差异更大，分离效 果更好。因而要引入的这一能消除蛋白质自身所带净电荷的物质在电泳体系下应带负电荷。另一方面， 我们要引入的物质应能与蛋白质普遍稳定地定量结合，结合后不同分子量的多肽链形状类似，使各多肽 链间的差别集中在分子量上。通过试验与实践，人们找到了一种双亲性物质即SDS, SDS是十二烷基硫

7、酸钠的简称，是一种很强的 阴离子表面活性剂，SDS以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，由于SDS的结合，所引入的净电荷大约为蛋白质本身净电荷的10倍，使SDS-蛋白质复合物所 带电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷的不同对电泳迁 移率的影响。在分子形状方面，SDS-蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴是恒 定的，在18A数量级，与蛋白质种类无关，棒的长轴是变化的，其变化正比于蛋白质分子量。说明SDS 和蛋白质结合所形成的SDS-蛋白质复合物消除了由天然蛋白质形状的不同而对电泳迁移率的影响。2、

8、在SDS的存在下，蛋白质在电场中泳动时其迁移率仅与蛋白质分子质量有关。二者的关系式为:IgM = a-bRm其中，M为相对分子质量，Rm为相对迁移率一蛋白质在凝胶中的迁移距离与指示剂前沿距离的比值, a、b为常数。从上式可知，蛋白质分子质量的对数与蛋白质迁移率呈线性负相关。在同一块电泳凝胶上 对一组己知分子量的标准蛋白质和蛋白样品分别进行SDS-PAGE分析，以标准蛋白的迁移率为横坐标，以 分子质量的对数为纵坐标绘制标准曲线，从未知蛋白质的迁移率即可求出蛋白质亚基的分子质量。三、仪器与试剂实验材料：实验四麦清蛋白脱盐样品：实验试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）；丙烯酰胺（Acr）；甲叉双丙烯酰

9、胺（Bis）；十二烷基硫酸钠（SDS）： N,N,N“-四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铉；甘油；筑基乙醇：异丙醇；漠酚蓝：考马斯亮蓝R-250： 甘氨酸：盐酸；乙酸；冰乙酸。实验仪器：直流稳压电源（600V, 100mA）；移液器；烧杯（50mlx2）；实验仪器：DYY-IH2稳压稳 流电泳仪（北京市六一仪器厂）；DYY-III2电泳槽（北京市六一仪器厂）：微量进样器50|J I （上海安亭微 量进样器厂）；大培养皿一套.试剂配制:试剂名称配制方法分离胶贮备液Tris 18. 17g, SDS0.4g,溶于水，用 3NHCI 调 pH 到 8.8, 水定容至 lOOmL Trisl.5M,

10、 SDS0.4%浓缩胶贮备液Tris 6.06g, SDS0.4g,溶于水，用 3NHCI 调 pH 到 6.8, 水定容至 lOOmL TrisO.5M, SDS0.4%Acr/Bis贮备液Acr 30. 0g, Bis 0.8g,去离子水溶解后定容至 100ml10%过硫酸铉溶液lg过硫酸铉溶于10ml去离子水中（当天配置）电极缓冲液Tris 3. 03g,甘氨酸 14.41g, SDSl.Og,去离子水溶解后定容至1000ml样品提取液（PH8.0 Tris-HCl缓冲液）Tris6. 05g,甘油50ml,筑基乙醇25mL漠酚 蓝0.5g, SDSlOg,溶于水，用HCI调节pH至8.

11、0,水定容至500ml四甲基乙二胺（TEMED）原液，冰箱保存染色剂0.4%考马斯亮蓝R-250,50%甲醇，7%乙酸脱色液20%甲醇，7%乙酸实验仪器：DYY-III2稳压稳流电泳仪一套（北京市六一仪器厂）、烧杯50mlX 3,微量进样器（上海 安亭微量进样器厂）、大培养皿一套、微量可调手动移液器（大龙）。四、实验方法1、贮液配制（教师完成）按照实验指导43页配制贮液，注意：配好的丙胶贮液盛于棕色瓶中置冰箱中保存，可放12个月； 过硫酸铉和染色液应当天配制；电极缓冲液用时稀释10倍：如有不容物应当过滤。2、凝胶的制备（1）将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。（2）安装电泳槽。安装时

12、，注意旋紧螺幼.时要均衡用力，以免夹碎玻璃片。（3）用2%琼脂封底，以防漏胶。（4）按下表所示配制分离胶名称分离胶缓冲液Acr/Bis贮备液去离子水TEMED过硫酸铉用量（ml）2.74.53.70.0050.2在小烧杯中混匀后，立即灌胶。灌胶时，将电泳槽稍倾斜，用手扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片 顶端，小心将溶胶倒入两玻璃片之间，灌至据短玻璃片顶端2cm左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在 胶的上层小心轻缓地覆盖23mm的水层。灌注水层是要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果， 刚加水时，可以看出界面，后逐渐消失；等到再出现界面时，表明分离胶已经聚合，再静置一会儿，将 水倒出，用滤纸条从一

13、侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，准备灌注浓缩胶。（5）按下表配制浓缩胶名称浓缩胶缓冲液Acr/Bis贮备液去离子水TEMED过硫酸铉用量（ml）1.250.753.00.0050.02混匀后立即灌胶，操作同上，至胶面与短玻璃片顶端平齐，立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，使短玻璃片一侧电极缓冲液没过玻璃片顶端，长玻璃片一侧电极缓冲 液没过电极丝，然后小心拔出梳子，准备点样。3、样品的处理Marker：市侈标准样品按要求制备。待测样品：麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获峰值管制备的SDS-PAGE样品。所有样品于沸水浴中加热5min,冷却后上样。上样量：Marke

14、r 201,待测样品4川、10口1、20川、30川、50pL4、电泳接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）。打开电源开关，调节电流，初始时控制在15mA左右，当 前沿进入分离胶后，可调节电流到25mA左右。实验中漠酚蓝前沿指示剂不能跑丢。5、检测电泳结束后，取出胶板，现在水中浸泡lOmin,以浸出部分SDS,然后把胶板转到染色液中过夜， 将蛋白质固定并染色（或加热2h,在通风橱中操作）。然后用脱色液脱至条带清楚，观察记录结果。6、测定蛋白质样品的迁移率和未知样品的分子量用卡尺或坐标精确测量漠酚蓝和各种蛋白质迁移的距离，记漠酚蓝迁移的距离为d,蛋白质迁移的 距离为Ch，根据下面的公式计算出各种蛋白

15、质的迁移率Rm： Rm=d2/d】。以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量的对数值为纵坐标作图。然后给句待测样品的迁 移率，在图上查出其对应的分子量。并由所得结果分析实验四麦清蛋白初步提取的实验效果以及后续进 一步分离纯化的方案。五、数据整理实验得到的电泳条带照片如下图1:麦清蛋白图1电泳条带照片116.066.245.035.025.018.414.4测量结果如下表:漠酚蓝前沿djcm10.54Marker/kDa11666.245.035.025.018.414.4麦清蛋白d/cm1.072.053.244.416.217.808.712.41Rm=d2/di0.10150.1945

16、0.30740.41840.58920.74000.82640.2287六、结果计算与讨论及分析（一）结果计算与分析以marker蛋白的迁移率R.为横坐标，对应蛋白分子量的对数为纵坐标，做出本次实验的SDS-PAGE 分子质量测定标准曲线如下图2。图2 SDS-PAGE分子质量测定标准曲线y =-1.135X + 5.073 R2 = 0.963相对迁移率（匕）系列1线性（系列1）有上图可得,标准曲线的方程为y = -1.1355x +5.0731。其R2 = 0.9639,曲线可用。将麦清蛋白的相 对迁移率0.2287带入曲线方程，得到其分子量的对数为4.8134,则其分子量为65072Da

17、,约为65.1kDa。（-）讨论本次实验与上次的活性电泳不同，除了跑在最前面的漠酚蓝前沿，还有一个蛋白前沿。蛋白前沿的 产生是因为在实验中有些蛋白降解为较短的小肽段，分子量仅比漠酚蓝大一些，迁移速度超出了其他蛋 白，且在胶板中发生侧向扩散，形成蛋白前沿。同时，靠近蛋白前沿的部分有大量分子量较小的蛋白样 品聚集，它们并非我们需要的样品，因为分离胶不够长而没有分开。本次实验我组顺利的将marker的七条带均匀跑开并显现出来，说明这次实验中我组在操作上基本无 大的问题。对于最后一条marker带出现上翘情况，经与老师分析讨论后，认为对于偏向下部的条带尤其 是靠近底部的条带，会受到胶板边缘效应的影响，

18、会发生偏折。因此在今后的实验操作中，对于这种情 况，应避免使用此处的marker进行计算。我们指定了棠近Marker第二条带的一条颜色很深的条带作为目标蛋白，这是因为这一蛋白含量相对 较高，与其他蛋白明显分离开来。通过上面的计算，得到这种蛋白的相对分子质量为65.1kDa。在对Marker进行作图的时候，我们发现116.0kDa的条带并不在直线上，其迁移的距离明显超过了 应有的迁移距离，说明在电泳过程中这个蛋白迁移速度过快。考虑到其他条带的迁移正常，我们认为可 能的原因有两个：一是Marker本身的质量问题，标称116.0kDa的蛋白分子量不足116.0kDa；二是凝胶 组成的问题。实验中所用

19、的凝胶孔径过大，导致凝胶对分子量最大的标准蛋白的阻碍作用不足，使这个 蛋白迁移速度超出了本来应有的速度。七、结论与展望1、本实验中，我们利用SDS-PAGE测定实验四纯化的麦清蛋白的分子量，得到目标蛋白的分子量为 57.8kDao实验说明SDS-PAGE作为目前最常用的测定蛋白质分子量的技术，原理科学、操作可行，能够 满足科学研究和生产实践的需要。2、本实验得到的电泳图谱说明，经过实验四的凝胶过滤层析脱盐处理，得到的麦清蛋白中仍然含有 一定量的杂蛋白。在经过考马斯R-250染色后发现胶板上有零星的蓝黑色斑点，经分析讨论为样品及操 作中残留的杂蛋白的影响。因此如果要得到纯度更高的麦清蛋白，就要进

20、行进一步的分离纯化操作。由 于SDS-PAGE无法像DNA的琼脂糖电泳那样将样品回收，所以必须考虑其他的实验方法。由之前的实验 可知，层析技术是较为精细的蛋白质分离纯化技术，因此考虑采用层析实现进一步纯化。本次实验中， 我们还测定了麦清蛋白条带上下距离最近的两条条带蛋白的分子量，分别为59.9kDa和54.8kDao由此设 计合理的凝胶，先除去分子量比麦清蛋白小的杂蛋白，再除去分子量比麦清蛋白大的杂蛋白。最后再进 行检测，确定纯化效果。也可以针对所要分离的麦清蛋白设计特异性的配基，采用亲和层析的方法实现高效分离。3、SDS-PAGE作为变性电泳，测得的为多肽链的分子量。对于由一条肽链构成蛋白没

21、有什么影响， 但对于由多条多肽链组成的蛋白，则需要获得更多关于蛋白质的信息才能得到其全蛋白分子量。对于一 般的研究，利用SDS-PAGE即可满足要求。但对于需要明确了解某种蛋白分子量的研究工作，必须结合密 度梯度离心、凝胶过滤、质谱测定、氨基酸测序等不同方法，共同确定一个科学可信的分子量。八、思考题1、对照一下活性电泳（实验五）和此次变性电泳中各自的电极缓冲液的成分和离子浓度，是否相同？ 相关设计的可能原因会是什么？答：活性电泳电极缓冲液成分：Tris 6 g, Gly28.8g,溶于水定容至1000 ml, pH=8.3,使用时稀释10 倍。变性电泳电极缓冲液成分:Tris 3.03 g,

22、Glyl4.41 g, SDS 1.0 g,溶于水定容至1000 mL从中可以明 显的看出两种缓冲液是不同的。这次溶液较上次的电极缓冲液中甘氨酸与Tris浓度均提高了 5倍，并增 加了 SDSo电极缓冲液中加入SDS,保证了 SDS-蛋白复合物始终处于存在SDS的环境中，保证整个电泳过程中 SDS与蛋白质的充分结合。而离子强度增加，一方面用较高的环境离子强度来掩盖SDS-蛋白复合物微小 的电荷差异，另一方面Glv浓度更高，浓缩效应更加明显，使条带更加清晰。2、连续做了两次电泳，所用仪器设备和试剂等完全相同，不同的只是电泳类型和动手操作，但电泳 图谱的效果却差异很大，SDS-PAGE的图谱明显的

23、清晰稳定，请分析一下如此“神速的进步”主要的原因 是什么？给我们什么启发？答：（1） “进步”主要原因有以下几点： 本次电泳所用的电极缓冲液离子强度更大，浓缩效应更明显，使样品得到更好地分离。 本实验为SDS变性电泳，蛋白质的迁移率只与分子量有关，分离的依据单一明确，相同或相近分 子量的蛋白分子聚集在一起，形成很窄的条带；在活性电泳中，不同蛋白质因各自电荷性质、分子大小 和形状的不同，在电场中表现出不同的迁移率，不利于相同性质蛋白质的集中，条带弥散。 本次实验采用考马斯亮蓝R-250对蛋白进行染色，灵敏度在0.1“1昭。而实验五中用联大茴香胺染 液进行染色，染色灵敏度远低于本实验，因此本实验的

24、条带更加清晰。（2）两次电泳实验，我们针对不同的实验目的进行了不同的具体设计，得到的结果大不相同，这就 说明对于不同的目的，必须针对性的选择实验方法。同时我们看到，变性电泳之所以条带更加清楚，很 重要的原因是分离依据更加明确，因此在物质的分离、纯化过程中，要尽量将物质之间的差别扩大，找 到更加明确的分离依据。3、请探讨一下生物研究中，理论和技术的关系，你的观点？答：在生物研究中，理论和技术是相辅相成的。理论是技术的基础，技木是理论的应用。对现代的 研究，技术的发明不再是爱迪生时代的作坊式产物，而是要以科学可行的理论基础作为前提，并经这种 基础转化为现实的可操作性。而这一过程需要经过反复的实践检

25、验，不断解决应用中遇到的实际问题。 而在技术的应用过程中，无法通过优化原有技木来解决的问题就进一步催生了新的理论发现和技术发明 的动力，推动理论的突破和技术革新。九、实验小结本次实验中在制胶过程中灌封时琼脂糖溶液并没有很好的嵌入到两层玻璃板间隔处，导致后续浓缩 胶灌胶时出现轻微渗漏现象。本实验要进行迁移距离的定量测定，因此要明确漠酚蓝前沿的位置，但漠酚蓝在脱色的过程中会消 失，因此要把漠酚蓝前沿及以下的条带全部切除，以切除后的胶板下缘作为前沿位置。鉴于条带存在一 定量的弥散，我组确定切除部位是漠酚蓝尾部。本实验中在最后的观察过程中，因个人原因对胶板强度估计不足，造成胶板碎裂。因此总结在观察 胶板的时候应对胶板格外慎重，保持随时都有蒸偏水对其保持湿润状态，同时操作时应非常小心以免造 成胶板破损甚至毁坏。