中药制剂分析-第七章-生物样品的成分分析医学.ppt

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1、第七章 生物样品的成分分析,第一节 生物样品的制备 第二节 生物样品的成分分析 第三节 应用举例,第一节 生物样品的制备,一、常用生物样品二、样品预处理,一、常用生物样品,（一）血样血样包括血浆、血清和全血，其中常用的是血浆。血浆是全血加肝素、草酸盐、枸橼酸等抗凝剂经离心后分取的上层清液，其量约为全血的一半。血清则是由血液中纤维蛋白元等影响下引起血块凝结而析出，离心后取上层清液而得。一般认为，药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度是与药物在作用点的浓度紧密相关的，即血浆中药物浓度可以反映药物在体内(靶器官)的状况。目前采用血药浓度的测定方法，大都测定原型药物总量，主要用于药动学、生物利用度、

2、药物浓度监测等研究。（二）尿液尿液主要用于药物代谢等研究。体内药物清除主要是通过尿液，以原型或代谢物及缀合物形式排出。尿液药物浓度较高，收集量可以很大，但尿液浓度变化较大，尿中药物浓度改变不直接反映血药浓度，尿液与血液中药物浓度的相关性不理想。此外尿液的采集具有在短时间内不可能多次取样，排尿时间较难掌握以及不易采集完全等缺点。,一、常用生物样品,（三）唾液唾液可用作药物浓度监测及药代动力学研究。唾液中药物浓度通常与血浆浓度相关，因此将唾液作为样本，就成为简便的、无损害的并能反映血药浓度的方法。唾液的采集不受地点、时间的限制，容易获得，且许多用于血浆测定的方法稍加改进即可用于唾液的药物浓度测定。

3、唾液药物浓度一般比血浆药物浓度低，但两者存在着恒定的比例关系，通过测定唾液药物浓度可推断血浆中药物浓度。与血浆药物浓度相比，唾液中药物浓度变化较大。此外，取各种脏器组织制成组织匀浆，在研究药物的体内分布、积蓄或代谢过程中常常使用。生物样品中往往存在很多酶，使样品处在变化之中，所以取样后最好立即分析，并应采取一切措施，如调pH值、加有机溶剂等，将待测成分转移到稳定状态。对血浆、血清样品，应尽快从全血中离心分离出来，一般最迟不超过24小时，分离后冰冻保存。尿液应在取样后立即测定，若收集24小时或更长时间，不能立即测定时，应置4冰箱保存；若在室温保存，应在采样后立即加入防腐剂；若需放置较长时间则需冷

4、冻贮存。,二、样品预处理,样品预处理是生物样品成分分析中极为重要、困难和繁杂的一部分。因为，药物在体内可以多种形式存在，如游离型和蛋白结合型，代谢物和缀合物等，需分别测定；待测物浓度很低，生物样品组成复杂，有众多内源性成分和各种潜在干扰物存在；待测成分类型众多，性质各异，很难制定固定的样品处理程序和方式。因此，样品预处理必须综合考虑成分类型、理化性质、存在形式、浓度范围、测定目的、选取的生物样本类型及测定方法等多种因素，采取相应的分离步骤和净化技术。,二、样品预处理,（一）预处理方法选择依据1.待测成分理化性质 样品的分离制备与分析方法均依赖于待测成分及其代谢物的理化性质，如成分的酸碱性、极性

5、、挥发性、光谱特征、功能团性质、化学稳定性、蛋白结合程度等。2.待测成分浓度范围 生物样品中待测成分浓度相差悬殊，对待测成分浓度高的样品，预处理要求可稍低；浓度越小则样品净化富集的要求越高。3.测定目的 测定目的不同，对样品要求也不同。如需测定代谢物，则要求代谢物从缀合物中释放出来，并在不同pH值介质中分离，以获得酸性、中性或碱性代谢物。4.生物样品类型 不同的生物样品处理方法不同。例如，血浆、血清及组织匀浆等样品含有大量蛋白质，常需去除蛋白质后提取；而唾液有大量粘液蛋白，需离心沉淀除去；尿中药物大多呈缀合状态，常需采用酸或酶使缀合物水解。5.测定方法 样品制备和需要净化的程度与所用测定方法是

6、否专属，是否具分离能力等有关。例如，不具有高的分辨率的光谱分析法与兼有分离作用的色谱法相比，前者对样品分离纯化的要求就要比后者高。又如在各种免疫测定中通常不必考虑成分的分离，只需采取简单的浓集，这是因为免疫测定法具有很高的特异性。,二、样品预处理,（二）提取1.除去蛋白质(1)有机溶剂沉淀法：采用有机溶剂如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等沉淀蛋白质。沉淀蛋白的效力由强至弱依次为乙腈、丙酮、乙醇和甲醇。其中用乙腈除去蛋白质，产生的沉淀容易分离，应用比较广泛。当用13体积的有机溶剂时，可使90以上的蛋白质沉淀。(2)盐析法：加中性盐如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，利用盐析作用使蛋白质沉淀。(3)酸性试剂沉淀法

7、：常用的酸性沉淀剂有三氯醋酸、高氯酸、苦味酸等，其中10三氯醋酸是最常用的蛋白沉淀剂。但三氯醋酸试剂中常含有杂质，致使一些方法的空白值偏高，其次是除去蛋白质后如采用乙醚为提取溶剂，三氯醋酸会溶入乙醚中干扰测定。(4)酶消化法：在温和的理化条件下，水解生物蛋白，将与蛋白结合的成分释放，对蛋白结合率强的成分可显著改善回收率，避免成分在强酸下水解和较高温度时降解。采用HPLC检测时，无需再进行过多的净化操作。常用的蛋白水解酶有枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。其中枯草菌溶素(一种细菌性碱性蛋白分解酶)最为常用，在pH7.011.0范围内使蛋白质降解，在5060具有最大活力。加入蛋白酶激活剂，可减

8、少酶用量和缩短活化时间，如咖啡因与胃蛋白酶合用，氯化钙与胰蛋白酶合用等。(5)其他方法：采用超滤法、透析法、微孔滤膜过滤法，可除去体液样品中的蛋白质，用于测定血清或血浆中游离待测成分的浓度。但与蛋白结合的待测成分未能被解脱出来而不能检出。,二、样品预处理,2.缀合物水解 药物在体内经二相代谢后，在血浆及尿中多呈缀合物形式(葡萄糖醛酸苷或硫酸酯)存在。其极性均大于母体药物，属亲水性或在生理pH值下解离的成分，不易被有机溶剂提取，需要通过水解处理，使缀合物中的成分或代谢物游离出来，再用有机溶剂提取。常用缀合物水解方法有：(1)酸水解：酸水解通常使用无机酸，如盐酸。该法简便、快速，但与酶水解相比，专

9、一性较差，部分成分在水解过程中可能发生结构改变。(2)酶水解：通常使用的水解酶是葡萄糖醛酸苷酶和芳基硫酸酯酶。前者可专一性地水解药物的葡萄糖醛酸苷，后者可水解药物的硫酸酯。在实际应用中也常使用两者的混合物葡萄糖醛酸苷-硫酸酯混合酶。与酸水解相比，酶水解专属性强，条件温和，一般不会引起被测物分解，缺点是酶水解时间长，费用大，可能引入粘液蛋白等杂质。(3)溶剂解：某些药物的硫酸酯，在加入提取溶剂进行提取过程中，会发生分解，称之为溶剂解。,二、样品预处理,（三）分离与净化1.液相提取(液-液提取)(1)提取率(萃取率)：在生物样品成分分析中，由于样品量少且待测成分含量低，分析的样品数量又较多，通常不

10、采用反复提取(萃取)的方法，一般提取(萃取)一次(至多两次)即可。对一般分析而言，萃取率(提取率)不低于50，就基本符合要求。,二、样品预处理,(2)影响提取率的因素：水相pH值：水相pH值对于酸、碱性成分的提取率影响很大。pH值的选择主要与待测成分的pKa值有关。一般来说，碱性成分的最佳pH值应高于其pKa值23个单位；酸性成分的最佳pH值应低于其pKa值23个单位；中性成分可在任一pH条件下被提取，但以在pH值偏高的情况下进行提取较好。为保证提取率的重现性，多采用缓冲溶液，以保持在提取过程中溶液pH值稳定。提取溶剂：理想的提取溶剂对被测成分应具有大的亲合力；极性较小，与水不互溶；沸点适宜；

11、不影响紫外检测；价廉，无毒，化学性质稳定等。为了减少容器对待测成分的吸附损失，提高提取率，可在非极性提取溶剂(如烃类)中加入少量醇，如庚烷中加1甲醇，己烷中加2异戊醇或丁醇等。离子强度：在水相中加入盐如NaCl，增加离子强度，可降低成分在水相中的溶解度，有利于溶剂提取。,二、样品预处理,(3)提取技术：通常不采用反复提取的方法，多半进行一次(至多两次)提取，在用酸碱回提时也只进行一次。一般不考虑“提尽药物”。提取溶剂必须精确加入，提取液要定量分出，其他操作应与建立标准曲线时完全相同，并进行平行操作。有机溶剂与水相的体积比一般为1:1或2:1，混合方式多采用密塞情况下振荡器振荡、涡动混合器旋摇或

12、首尾颠倒混合。玻璃容器表面会对成分产生吸附，为减少吸附可在提取溶剂中加少量异戊醇、二乙胺等，或对玻璃仪器进行硅烷化处理。,二、样品预处理,(4)离子对提取：适用于高度电离的亲水性强的极性化合物的提取，如尿液中水溶性大的缀合物(结合物)，常规的溶剂萃取法很难将它们萃取出来。应用离子对提取法，则很多成分的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯可与烷基季铵离子形成脂溶性很强的离子对配合物，易被有机溶剂萃取。常用于离子对萃取的反离子有烷基或芳基磺酸盐、无机酸根(如ClO，Cl)等，用于呈阳离子状态的成分(如含N碱性成分)；412个碳原子的烷基铵类(其中最常用的为四丁基铵)用于呈阴离子状态的成分或代谢物，如酸性成分、葡萄

13、糖醛酸苷等。萃取溶剂常用氯仿、二氯甲烷等。,二、样品预处理,2.固相提取(液-固提取)固相提取是近年来发展起来的一种简便快速的生物样品分离净化方法，避免了液相提取时，易产生乳化现象，待测成分易损失的缺陷。且溶剂用量少，提取效能和回收率高，操作安全、省时、速度快，引入污染少。选择合适的溶剂洗涤后，固相柱可再生重复使用。若将提取柱与HPLC、GC系统相连，采用柱切换技术，可以达到自动化的样品处理。,二、样品预处理,(1)固相提取操作：固相提取纯化样品的方式通常可分为2种：选择性提取：将待测成分保留在柱上，杂质随样品溶剂或洗脱液洗出，然后以小体积溶剂洗脱待测成分。选择性冲洗：将待测成分和杂质保留在柱

14、上，然后选择适当溶剂冲洗杂质，保留待测成分；或杂质被保留，待测成分被洗脱。(2)影响固相提取的因素：合适的洗涤剂和洗脱剂。流速：流速太快会使待测成分与吸附剂不能充分接触，导致与杂质的分离度下降，样品流失，回收率降低或不能重现。上样量：超载易引起回收率差或不稳定。判断是否超载，可进行样品突破性实验。方法为取已知浓度样品液：A.小体积上柱；B.用合适的洗脱方法洗脱；C.测定百分回收率；D.增大样品上样体积，重复AC步；E.重复D。绘制回收率与样品上样体积曲线，当回收率下降时，表明样品超载。,二、样品预处理,（四）富集在样品提取纯化过程中，不仅待测成分得到了纯化，而且还有可能被初步浓集，但往往不能直

15、接供GC或HPLC测定用，因为微量的待测成分仍然分布于较大的提取溶剂之中，而GC和HPLC都受进样量的限制。富集方法可采用真空蒸发、减压冻干或通入气流吹干(一般通入压缩空气，遇氧不稳定的组分可改用氮气)。为了避免被测成分随溶剂一起挥发损失，可在通气前往提取液中加入少许沸点稍高的溶剂起固定作用。例如，在乙醚提取液中加入乙醇后再通气流蒸发。,第二节 生物样品的成分分析,一、分析方法的设计与评价二、常用的分析方法,一、分析方法的设计与评价,生物样品成分分析方法的建立是生物样品成分分析的重要内容。在设计分析方法前，应在做好文献研究工作基础上充分了解待测成分的特性与在生物样品内的状况，明确测定目的和要求

16、。如拟建立的方法是用于药代动力学研究，则要求方法应具有一定的灵敏度和准确度，具有较宽的定量线性范围，而不强调简便、快速，若是用于临床药物浓度监测，则要求分析方法必须简便、快速。如果要求同时测定母体成分和代谢物，则应选择具有分离能力或专属的测定方法。,一、分析方法的设计与评价,（一）方法建立分析方法初步拟定后，需通过一系列实验工作，选择最佳实验条件及验证所拟定的方法是否适合实际样品检测。分析方法的建立一般应包括下列步骤：1.对照品测定 取待测成分对照品适量，按拟定方法测定，求得浓度与测定响应值之间的关系，进行线性范围、最适测定浓度、检测灵敏度、测定最适条件(如pH值、温度、反应时间等)等的选择。

17、2.空白样品测定 取空白生物样品，按拟定的方法进行处理，测定空白值(或色谱图)，了解方法的灵敏度和专属性。3.以水代替空白样品，添加对照品测定 以水代替空白生物样品，添加一定量对照品后按拟定方法进行测定，了解提取回收率及最低检测浓度，对提取溶剂、富集方法等条件进行选择。4.空白样品添加对照品测定 于空白生物样品中，添加一定量对照品后按拟定方法进行测定，求得样品回收率数据，建立标准曲线。5.样品测定 取待测样品按拟定方法测定，考察样品中待测成分代谢和蛋白结合情况。,一、分析方法的设计与评价,（二）方法评价分析方法建立后必须进行方法学考察与评价。评价指标有精密度、准确度、灵敏度、专属性或选择性、可

18、测浓度范围、测定所需时间以及对生物样品的适应性等。,一、分析方法的设计与评价,1.准确度 分析方法的准确度常用回收率来评价，回收率越接近100越好。但因生物样品组分复杂，待测成分含量低，样品量少，分离纯化步骤较多，一般很难达到高的回收率。对于一个分析方法来说，更为重要的是每次测定所得回收率要保持恒定，虽然有时回收率较低，但只要重现性好，通过校正后仍可采用。回收率根据测定方法不同可分为绝对回收率和方法回收率。(1)绝对回收率：又称萃取回收率、提取回收率，用于评价分析方法的萃取效率，与生物样品内成分检测灵敏度有关。绝对回收率应考察高、中、低3个浓度，低浓度选择在定量限附近，高浓度在标准曲线的上限附

19、近，中间选一个浓度。绝对回收率若能达到5080，应认为是令人满意的。用内标法测定时，应注意待测成分与内标物各自用外标法测得的绝对回收率相近(两者相差应小于10)。(2)方法回收率：取高、中、低浓度的待测成分对照品添加到空白生物样品中，按拟定方法测定(每个浓度至少测定5份)。由测定量与加入量计算方法回收率。除定量限外，各浓度点测得的平均值偏离实际加入量应小于15(定量限浓度应小于20)。在测定回收率时，应注意添加成分量必须与实际测定量相近，添加成分必须与实际存在状态相似，必须同时做空白试验。,一、分析方法的设计与评价,2.精密度 精密度用来评价一组测量值彼此符合的程度。精密度通常采用高、中、低三

20、种浓度进行测定。低浓度选择在定量限附近，高浓度在标准曲线的上限附近，中间选一个浓度，每个浓度平行测定57次，计算测定结果的相对标准偏差RSD。如果RSD小于5，表示精密度良好。精密度可分为日内精密度(同一天内对同一样品多次测定，计算RSD)和日间精密度(连续数天，每天测定同一样品，计算RSD)。,一、分析方法的设计与评价,3.灵敏度 灵敏度常用以下几种表示方法：(1)检测限(limit of detection，LOD)：生物介质中待测成分的最低可测度(或绝对量)，通常以信噪比为23时的被测物的绝对量来表达。(2)定量限(limit of quantification，LOQ)：生物介质中待测

21、成分可定量测定的最低量。测定方法与检测限相同，所不同的是，定量限规定的最低测得浓度应该符合精密度和准确度的要求。通常以标准曲线的最低浓度点作为定量限。在进行中药制剂生物利用度实验时要求定量限至少能满足测定35个半衰期时的成分浓度或Cmax的1/101/20时的成分浓度。(3)最低检测浓度：可进行定量测定的某一成分的最低浓度。最低检测浓度等于定量限与进样体积之比。提高分析方法检测灵敏度，可通过提高仪器灵敏度、降低仪器噪音；提高样品富集程度或进样量；改变色谱条件，改进预处理方法，消除干扰，降低空白值等途径实现。,一、分析方法的设计与评价,4.专属性 又称选择性，是指样品中含有其他共存物质时，该法定

22、量测定待测成分的能力。测定时，通常取6个个体空白样品，采用拟定的方法进行测定，所得结果与接近于定量限浓度的被测成分的纯溶剂溶液所得结果进行比较。在成分、代谢物、内标物的tR处不应有大的干扰。如果大于10的空白样品显示大的干扰，则应改变拟定的方法，以消除干扰。在报告专属性时，若采用色谱法测定，至少要提供空白样品色谱图，空白样品添加对照品色谱图及样品色谱图。,一、分析方法的设计与评价,5.线性范围 将待测成分对照品加入空白生物样品中，制成一系列不同浓度的对照液，按规定方法处理、测定，绘制标准曲线，或计算回归方程，求出r值和浓度范围。一般来讲，相关系数r应大于0.99(色谱法)或0.98(生物法)。

23、标准曲线的制备一般由一个空白，一个零标准(空白样品加内标)和58个非零标准(系列浓度标样)组成，要求覆盖实际的样品浓度范围，包括定量限。并且通过实验测出的具有线性关系的浓度范围中最高浓度应为最低浓度的20倍以上。6.稳定性 稳定性考察包括长期贮存稳定性、短期室温稳定性和冷冻-解冻稳定性，以及贮备液稳定性等。,二、常用的分析方法,（一）光谱法在生物样品成分分析中，由于共存的内源性物质、代谢物等的干扰，样品一般要经过分离纯化，才能得到较好的分析结果。采用具有选择性的显色剂和反应条件，才可以不经分离，直接测定。由于方法灵敏度和选择性的限制，可见-紫外分光光度法应用较少。荧光法具有较高灵敏度，专属性较

24、强，可用于定量分析，但要求待测成分应能产生荧光，无荧光者则需通过适当处理后方可检测。,二、常用的分析方法,（二）色谱法高效液相色谱法在生物样品成分分析中应用较多。具有适用范围广，可在室温下进行；样品预处理简单；分离效率高，流动相选择范围广；专一性较高等优点。其中胶束高效液相色谱和离子对高效液相色谱用于生物样品成分分析具有独到之处。1.胶束色谱 胶束色谱是一类应用胶束溶液(一定浓度的表面活性剂溶液)作为流动相的色谱。胶束色谱的理论是在反相色谱中建立的，若不特指，胶束色谱一般指反相胶束色谱。表面活性剂在极性溶剂，如水中形成正相胶束，可用于反相色谱。胶束色谱中常用的表面活性剂为阴离子的十二烷基磺酸钠

25、、阳离子的十六烷基三甲基溴化铵、中性分子的聚氧乙烯(23)十二烷醇，以及非水反相胶束的丁二酸二辛酯磺酸钠。胶束高效液相色谱梯度洗脱时，不需要流动相与色谱柱之间的再平衡，不影响电化学检测器的使用，能改善荧光检测的灵敏度。可免去生物样品预处理步骤，直接测定待测微量成分，如可将血清或尿液直接进样，而不会引起反相色谱柱柱压升高或蛋白质沉淀。胶束流动相选择性好、毒性小、价廉。分析省时，省样品。,二、常用的分析方法,2.离子对色谱 离子对色谱是由离子对提取的液-液分配色谱发展而成的一种高速分离方法。借助高效液相色谱仪，离子对色谱在生物样品中的分析日渐广泛。离子对色谱分为正相离子对色谱和反相离子对色谱。,二

26、、常用的分析方法,二、常用的分析方法,（三）免疫分析法1.原理简介免疫分析的定量基础是竞争抑制原理。当一定限量的抗体存在于反应体系时，体系中标记抗原(Ag*)与未标记抗原(Ag)就与抗体(Ab)发生竞争结合。在一定量的Ag*，一定稀释度的Ab与待测的不同量Ag作用一定时间后，当反应达平衡时，总的标记抗原(T)按比例分布于游离形式(F)和结合形式(B)之间。测定F或B的量，即可求出不同待测抗原含量时的标记抗原的结合率。测定时通常先以一系列已知浓度的抗原(高度纯化的待测物的标准品)和一定量标记抗原与适量抗体进行反应后，测定各标准浓度抗原时的Ag*-Ab的强度，求出结合率，绘制出标准竞争抑制曲线或称

27、计量反应曲线。然后取一定量样品，按同法测定，根据样品中标记抗原与抗体的结合率，就可以从曲线上查出相应的被测抗原的含量。2.分类 免疫分析中按标记物的不同，可分为放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、化学发光免疫分析(CLIA)、荧光免疫分析(FIA)。根据抗原-抗体的反应达平衡后是否须将结合物(B)与游离标记物(F)分离，免疫分析可分为均项免疫分析(不分离)和非均项免疫分析(分离)。各种免疫分析的基本原理都是竞争抑制原理。人工抗原的制备和特异抗体的制备也相同，只是标记抗原(标记成分)的标记物不同，由此产生的测定方法也不同。,二、常用的分析方法,二、常用的分析方法,3.毛细管电泳免疫分析

28、(CEIA)利用抗原抗体复合物与游离的抗原、抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为免疫分析中的分离检测手段。该技术结合了免疫分析的高选择性、毛细管电泳的高分离效率和激光诱导荧光检测技术的高灵敏度检测。与传统免疫分析相比有很多优势：(1)免疫结合反应在均相溶液中进行，反应一般在510内即可达到平衡。(2)毛细管电泳一般只需要纳升级的样品与微升级的缓冲溶液，很适合于微量免疫分析。(3)毛细管电泳的应用使传统免疫分析中繁烦的分离步骤得到简化，分离一般在几分钟内完成，结合在线的激光诱导荧光检测，大大提高了分析速度。(4)毛细管电泳的高分离效率能识别抗原与其类似物在结构上的微小差异，既可解决免疫分析中

29、的交叉反应性问题，又可以进行多组分同时分析。,第三节 应用举例,一、试验方法二、结果与讨论,一、试验方法,1.色谱与质谱条件 色谱柱为RESTEK Pinnacle II C18柱(150mm 2.1mm ID，5m)；流动相为甲醇-水-乙腈(60:20:20)；流速250L/min；柱温：室温。电喷雾ESI源；喷雾电压IS为5kV；雾化温度450；雾化气NEB(GAS1)为12L/min；加热辅助气AUX(GAS2)为6L/min；帘气CUR为12L/min；碰撞气CAD为3L/min；检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的离子分别为m/z 823.6643.5(人参皂苷R

30、g1)和m/z 969.7789.0(人参皂苷Re)。2.血浆样品处理 采用Waters固相萃取仪为固相萃取辅助装置。将SPE柱先后用甲醇和水各2ml活化。取血浆0.5ml移入已活化的SPE柱，减压使其恒速通过SPE柱。然后用水2ml清洗小柱，抽干，最后用甲醇1.5ml洗脱。收集洗脱液，35水浴中氮气流下吹干。残留物用流动相200L充分溶解后，过膜(0.2m)，经自动进样器进样20L，进行HPLC/MS/MS分析。3.方法学考察 取空白血浆0.5ml，加人参皂苷Rg1和Re混合对照品溶液，配置成系列血浆样品，其中人参皂苷Rg1的浓度为1.02，3.07，10.23，30.69，102.3，30

31、6.9和1023g/L，人参皂苷Re的浓度为1.05，3.15，10.5，31.5，105.0，315.0和1050g/L。按血浆样品处理方法提取后进样分析，以测得的峰面积Y对血药浓度X作线性回归。同法配置低、中、高3个浓度(人参皂苷Rg1浓度分别为3.07，30.69和818.4g/L，人参皂苷Re浓度分别为3.15，31.5和840.0g/L)的样品，按血浆样品处理方法操作，随标准曲线同时测定，计算方法回收率和日内、日间精密度。以提取后的色谱峰面积与空白血浆提取后加入对照品溶液后进样获得的峰面积之比，考察方法的提取回收率。,一、试验方法,在所选的试验条件下，人参皂苷Rg1和Re的保留时间分

32、别为1.66min和1.62min，血浆中内源性物质不干扰二者的测定。最低检测限分别为0.71g/L和0.84g/L。该方法人参皂苷Rg1和Re分别在1.0231023g/L和1.051050g/L浓度范围内线性关系良好，回归方程分别为Y4.71103X+1030(r0.9995)和Y1.41103X+287(r0.9982)，定量下限分别为1.020.03g/L(n5)和1.050.04g/L(n5)；二者在低、中、高三个浓度的回收率、日内和日间精密度(RSD)结果见表6-3。经考察，血浆样品中人参皂苷Rg1和Re经过3个冷冻-解冻循环和20条件下保存29天仍保持稳定，制备后的样品室温放置至少6小时后保持稳定。,思考题,1.生物样品成分分析具有哪些特点？2.简述中药制剂成分体内代谢反应及特点。3.简述生物样品中去除蛋白质的常用方法。4.影响液相提取方法中提取率大小的主要因素有哪些？5.固相提取中，常用固相柱填料有哪些？上样前如何处理？6.简述生物样品成分分析方法建立的一般步骤。7.如何评价一个体内分析方法的优劣？8.简述免疫分析的基本原理。,