实时荧光定量PCR的原理及实验.docx

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1、实时荧光定量PCR的原理及实验无论是对遗传病（如地中海贫血和血友病）、传染病（如肝炎和艾滋病）或肿瘤 进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治 疗效果，定量pcr技术都可以发挥很大作用。定量pcr技术的最新进展是实时荧 光定量。该技术借助于荧光信号来检测pcr产物，一方面提高了灵敏度，另一方 面还可以做到pcr每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定 ct值，从而根据ct值确定起始dna拷贝数，做到了真正意义上的dna定量。这 是dna定量技术的一次飞跃。根据最终得到的数据不同，定量pcr可以分为相对定量和绝对定量两种。典 型的相对定量如比较经过不同

2、方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化， 得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或 浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量pcr又可以分为taqman探针和sybr green i荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得 数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验 方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的 校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的 客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定

3、性实 验一样，定量pcr也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出 现的问题。1为什么终点定量不准确？我们都知道理论上pcr是一个指数增长的过程，但是实际的pcr扩增曲线并 不是标准的指数曲线，而是s形曲线。这是因为随着pcr循环的增多，扩增规模 迅速增大，taq酶、dntp、引物，甚至dna模板等各种pcr要素逐渐不敷需求， pcr的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的taq酶都被饱和以 后，pcr就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的pcr反应 体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即 使是重复实验，各种条件基本一致，最

4、后得到的dna拷贝数也是完全不一样的， 波动很大（图1）。图1同一个样本重复96次pcr的扩增曲线传统的定量方法，如漠乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等， 测定的都是pcr的终产物，而不是起始dna拷贝数。由于pcr的终产物量与起始 模板量之间没有线性关系，所以根据最终的pcr产物量不能计算出起始dna拷贝 数。对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是 pcr放大之前标本中的dna原始拷贝数，经过pcr扩增以后的dna拷贝数已经不 能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据ct值确定dna 起始拷贝的数量。2为什么ct值与起始模板拷贝数成线性

5、关系？ct值的定义是pcr扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐 点所对应的循环次数。从图1的重复实验中可以直观地看到，尽管平台期dna 拷贝数波动很大，ct值却是相对固定的。如果用不同浓度的dna作pcr，可以看 出dna浓度越高，ct值越小。dna浓度每增加1倍，ct值减小1个循环。ct值 与模板dna的起始拷贝数成反比。这一结论可以从数学上严格证明。为使表达式简便，以下推导忽略pcr效率 等细节。如果考虑这些因素，可以在方程上增加修正项。这些修正项的增加并不 改变方程的线性性质。一般地，我们有rn=rb+xo(1+ex)nrs,也就是说第n次pcr循环时的荧光信 号强度(rn

6、)等于背景信号强度(rb)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，rs) 与分子数目的乘积。当循环次数n = ct时，则有rt=rb+xo(1+ex)ctrs。两边取 对数，得 log(rt -rb) = logx0 + ctlog(1+ ex) + logrs 整理此式，ctlog(1+ ex)= -logx0 + log(rt -rb)-logrs。C log log(Rr-R)log一1%(1 +残) 1箜(1 +助所以对于每一个特定的pcr反应来说，ex、rt、rb和rs都是常数，所以ct 值与log x0成反比，也就是说，ct值与起始模板拷贝数(x0)的对数成反比，起始 dna浓度每

7、增加1倍，ct值减小1个循环。根据ct值的定量是精确和严格的，而传统的终点定量则比较粗放。如果读者有兴趣的话，也可以假设pcr的效率(即ex)为100%，从上式推算 出定量pcr标准曲线的最佳斜率和ct值的最佳范围。3怎样确定ct值？实验操作中，ct值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发 射时所对应的pcr循环次数(图2)。基线上方”也就是阈值高度的量化定义是 基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。阈值所在的横线与pcr扩增曲线的 交点所指的pcr循环次数就是ct值。基线范围的定义是从第3个循环起到ct值 前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般取第3到第15个

8、循环之间。早于3个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校正信号往往波动比 较大，不是真正的基线高度；而在ct值前3个循环之内，大多数情况下荧光信 号已经开始增强，超过了基线高度，都不宜当作基线来处理。Ct值图2 ct值和阈值显然，ct值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，ct值是 一个完全客观的参数。ct值越小，模板dna的起始拷贝数越多；ct值越大，模 板dna的起始拷贝数越少。正常的ct值范围在18-30之间，过大和过小都将影 响实验数据的精度。4荧光信号和定量数据的归一化虽然大多数定量pcr仪都会自动扣除本底，但是仍然需要注意荧光信号强度 和定量数据的归一化校正，以便不同样本

9、之间的实验数据可以严格地相互比较。由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然 误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因 素对定量结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实 现，一般采用红色rox荧光，称为阳性参比信号。rox在反应缓冲液中的浓度是 固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。目 标基因和对照基因的信号除以阳性参比信号以后，即rn = r / rrox，就可以在同 样的起点上进行比较和各种计算。rox校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异（图3）。图3 rox荧光校正(左)

10、和不校正(右)对实验数据的影响归一后的荧光信号再扣除本底，就得到drn： drn = rn,样本-rn,空白。drn 是最后构建pcr实时扩增曲线的纵坐标。无论绝对定量还是相对定量，在得到实验结果后，还要考虑数据之间的可比 性问题。在实验操作中，取样都是以体积或重量为单位的，但是同样体积或重量 的样本所来源的细胞数目并不一样，所以拷贝/或拷贝/ng的定量数据相互之 间实际上并不可比。只有将这些数据归一到以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位 后，才可进行严格意义上的比较。这种校正可以通过适当的参比来完成。参比一般选用b-actin、gapdh、rrna 基因等管家基因。由于它们在细胞中的表达量或在基

11、因组中的拷贝数是恒定的， 受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。校正 方法为：dna样本/ dnaipc，或者dct = ct样本-ct, ipc。因为ct值与起始dna 拷贝数的对数是反比关系，可以证明，这两种计算方法在数学上是等价的。为了减少误差，目标基因和参比基因最好在同一反应管内同时进行定量测 定，所以这种对照称为阳性内对照(internal positive control，ipc)。要进行ipc 归一化校正，定量pcr仪必须具备多色检测能力，最好是4色。否则，目标基因 和参比基因只能分两管作定量，就不成其为内标了。5污染的预防和热启动为保证定量的准确性，

12、要预防非特异性pcr扩增和污染。常用的措施有使用 ung酶(uracil-n-glycosylase)和热启动。ung酶的作用原理是降解含有du的双链 或单链dna。它在50c激活，95c灭活。由于商用pcr试剂盒均以dutp取代 dttp，所以pcr产物都是含有du的dna链。在定量pcr开始前增加50c的保温 步骤，ung酶即可将已有的pcr产物降解破坏，防止可能造成的污染。普通的taq酶即使在室温下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入pcr 试剂的过程中、正式pcr开始前就会完成少量pcr扩增，增加了背景，影响定量 精度。而金牌taq酶经过特殊修饰，常温下其活性部位被封闭，没有活性；只

13、有 经过95c 10min的热启动以后，封闭被解除，才能开始dna链延伸，这样就最 大限度地减少了杂讯的生成。6标准曲线、重复实验和阴性、阳性对照定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数据进行统计处理，可以 将误差降低到最小。所以定量实验的每个样本至少要重复3次以上，严格的定量 更应当重复68次，以满足小样本统计的要求。如果作绝对定量，则标准曲线需要在5个点以上。标准曲线使用的标准品是 浓度已知的dna样本，可以自己制备，也可以购买商品化的试剂盒。其pcr反应 条件应当与未知样本的一致，以便在同一反应板上同时定量。阴性对照中不加模板dna，而以水或缓冲液代替，用于检验是否存在pcr污 染

14、。阳性对照则用于检验pcr试剂和实验操作上可能出现的问题。如果实验中设 立了 ipc，则ipc既可以用来校正数据，也可以起到阳性对照的作用。7 taqman探针技术原理taqman探针法是高度特异的定量pcr技术，其核心是利用taq酶的35 外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所 以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在taqman探针法的定量pcr反应体系中，包括一对pcr引物和一条探针。 探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有报 告基团(reporter, r)，如fam、vic等，3端标记有荧光淬灭基团(quencher, q)

15、， 如tamra等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收， 仪器检测不到信号。随着pcr的进行，taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的 探针，其35外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能 量不能被吸收，即产生荧光信号(图4)。所以，每经过一个pcr循环，荧光信 号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板 dna的拷贝数。TaqMan 探针下游引物图4 taqman探针的荧光信号产生机制taqman探针根据其端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的 taqman探针和taqman mgb探针。mgb探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团

16、 (non-fluorescent quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有mgb (minor groove binder)修饰基团(图5)，可以将探针 的tm值提高10c左右。因此为了获得同样的tm值，mgb探针可以比普通 taqman探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提 高。因为在模板的dna碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。 实验证明，taqman mgb探针对于富含a/t的模板可以区分得更为理想。图 5 taqman mgb 探针8 sybr green i荧光染料技术原理sybr green i是一

17、种只与dna双链结合的 荧光染料（图6）。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来 时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分 子的数量。sybr green荧光染料法定量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放 出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚 合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量 加大。图6 sybr green i荧光染料与dna双链的结合sybr green i荧

18、光染料能与所有的dna双链相结合，对dna模板没有选择性， 所以特异性不如taqman探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对 pcr引物设计的特异性和pcr反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一 种成本低廉的选择。9定量pcr仪简介目前在国内使用得比较多的荧光实时定量pcr仪有美国应用生物系统公司 (applied biosystems，abi)的 7000、5700、79007700 型和罗氏公司的 lightcycler 等。下面以abi最新推出的7000型为例作简单介绍。7000型荧光定量pcr仪设计满足临床检验、医学研究和基础实验的要求， 面向低通量全中等通量的用户。随机

19、配置的定量pcr引物和探针设计软件primer express非常有用，因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量pcr所需的 taqman 探针。7000型有实时动态(real-time)和终点读板(plate read)两种运行模式。实时 动态模式用于定量，测定dna或rna拷贝数。7000型可以动态显示pcr扩增曲 线的生成，定量的线性范围大于7个数量级，区分5000和10000个拷贝的dna 模板可信度达99.7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸 多态性(snp)分析等。当然，7000型也可以作为普通pcr仪使用。abi已经发 布12万个商品化的定量pcr试剂盒，覆盖

20、人类全部4万个基因，平均每个基因 3个检测试剂盒，为运用7000、7700、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。7000型最大特色是具备多色检测能力，荧光检测的波长范围为530590 nm，能够有效地分辨 famtm / sybr? green、victm / joetm、tamratm 和 roxtm 等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、snp分析、基因型分型和带阳性内 对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基 因进行定量，可以大大提高精度并节约成本。7000型支持两种定量化学：taqman荧光探针和sybr green i荧光染料。其 熔解曲线(dis

21、sociation curve)功能用于判断pcr扩增反应是否特异，有无杂带生 成。进一步阅读材料基本方法1 lie, y. s. and c. j., petropoulos. advances in quantitative pcr technology nuclease assays. curr opin biotechnol 9: 43-48.1998.2 orlando, c., p., pinzani, and m., pazzagli. developments in quantitative pcr. clin chem lab med 36: 255-269. 1998.绝对

22、定量3 becker k., d. pan and c.b. whitley. 1999. real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. hum. gene ther. 10: 2559-2566, 1999.4 de kok, j.b., hendriks, j.c., van solinge, w.w., willems, h.l., mensink, e.j., and swinkels, d.w. use of real-time quantitative pcr to compare

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24、): 238-46,2000.相对定量6 de kok, j.b., ruers, t.j., van muijen, g.n., van bokhoven, a., willems, h.l., and swinkels, d.w. real-time quantification of human telomerase reverse transcriptase mrna in tumors and healthy tissues. clin.chem. 46(3): 313-8,2000.7 moody, a., sellers, s., and bumstead, n. measuri

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