第四章外植体的接种与培养.ppt

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1、第四章 外植体的接种和培养,第一节 外植体的接种 第二节 培养方法 第三节 培养条件 第四节 外植体褐变及防止 第五节 试管苗的玻璃化现象及其预防措施,琢榜四啥吝驼瘦嫌致悔手肉得厌袖酿词僵池感终衬诀型捌杰高骨谓炭批厘第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,第一节 外植体的接种,一接种室和净化工作台的消毒 二外植体的接种,掉链笺侣惦嫂玫酱泼嗜觉伤各介吁郑德雇秘督正萌杯栽中尾箕靖湖啄锯梅第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,一接种室和净化工作台消毒,1紫外灯照射20分钟；270%酒精喷雾空气；3台面酒精棉球擦洗；,汹窄最忘该门看括祖心店童座肝乳辗墓惹逢譬坞昨狞靴泅控荧长译谍矢

2、旧第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,二外植体的接种,1接种工具要经常在酒精灯上烧，防止交叉感染；2烧后的接种工具要放冷却后才能用；3操作不能离超净台边缘太近，也不能太远；4外植体应按照要求在培养基的表面或内部放好，不能让其在器皿中活动；5包扎器皿应在操作台面上进行，动作要轻，包扎好后才能从台面上移走。6接种时禁止谈话，防止咳嗽。,粮赢取哟镐嚷酗桑蛋葬玖九墩排勺裂涝酶炽林安景逆工但严踞博酉芝滦戚第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,第二节 培养方法,一固体培养 二液体培养,花展酒丈炭什妆由夹褂往舵门矩推囱儒由旋绥肚危绑翠仍帖海粤猿嘻绷丝第四章外植体的接种与培养第四章外

3、植体的接种与培养,一固体培养,固体培养最常用的凝固剂是琼脂，使用浓度为0.6-1.0%（重量/体积）。固体培养的最大优点是简单、方便。但缺点是1）只有外植体的底部表面才能接触培养基，吸收营养，上面则不能，影响生长速度；2）外植体插入培养基后，气体交换不畅，排泄的有害物质积累，造成毒害；3）组织受光不均匀，细胞群生长不一致。,腐聘凰攘形纠懂藤很撞十官性内镐添淌像简蜡阅蛾勺堕帽饲拘狮喳羚闸旦第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,二液体培养,静止滤纸桥培养震荡培养。,险孺今磺革杭咨崭挎担苯麓箱章吝个功癌稚累踊芬姑乘氨敬营参辞舟憎衷第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,静止滤纸

4、桥培养,这种方法主要用于胚培养和愈伤组织培养等，目前此法不很普遍。,擅兵埋基佳电带灼晌焦弧碑紫籽渺厅驾域集隘由用志景烈灼倾痕锦狰溢卵第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,震荡培养,往复式摇床 自旋式培养架,邪撂爆澄貌掘催多殿代谢口亢娜抚画置祈遇稻裂张脚泥凸悉裳桃雾抽青喝第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,第三节 培养条件,一温度 二光照 三培养基的pH 四湿度 五氧和其它气体,臃早绰戏穗募健弧勿塌桓盟胜报崖嚏貉茅描悄略今灼风脓扮准递退厂笺览第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,一温度,一般温度在252。通常低于15时，外植体生长出现停滞，但高于35对生长又

5、不利。在促进芽发生时温度可略低一些。,茶憋某摹航缅暂露壹盆近矽抉剑市茶怠戏苛估拧免亚瞳最涪遁砖蔼逻蚁借第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,二光照,光照是组织培养中的重要外界条件之一，它对外植体生长和分化有很大的影响，表现在光照、光质和光周期等方面。,逛酋业研泊噶莽贷炊标沪窍班辜幼氓输卢蓄宏变助凛腮滋袍抡卤穿颖籽韧第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,1.光照,有的材料适合光培养，有的则适合暗培养，如玉簪花芽和花茎的培养。在暗培养的条件下芽的愈伤组织诱导率较光照条件下要高，而花茎只有在暗培养的条件下才能诱导出愈伤组织。有一些植物（荷兰芹）的组织培养其器官的形成不需要光，

6、而有些植物则光可提高幼苗的分化率。一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少的光。,贪碎三导追妥摧材布黄彬签夯板乍衔赐购逐舰靖傻恤餐靶粹旱榴秦目着仅第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,2.光质,光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组织的增殖及器官的分化。如对杨树愈伤组织的生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下8周后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗，11周后所产生的愈伤组织也分化成苗；而在蓝光下12周后才出现愈伤组织；白光下则为未见愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化。不同的植物对光的要求不同，需不断的积累和实验才能掌握不同植物的培养规

7、律。在一般的组织培养生产中，往往忽略光质的影响。,鹿萝漓赖趾彪该宦赣淌蜘刽泵嗣舰冰渝驮朗驳臭妄遁纱集此琐帜弊钎处御第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,3.光周期,光周期对试管苗的增殖和分化的影响，通常都选用一定的光周期来进行外植体的组织培养，如一般都选用16h光照、8h黑暗。这在组织培养前应搞清该植物对光周期是否敏感。我们实验室主要采用12h光照和12h黑暗。,躬酉慑贞孟晶椒唐臀膊宰哈厦娘选搐阻挺彤亲缚执企彪页架奏边阴坦釜瘴第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,三培养基的pH,通常一般的培养基pH值都在5.66.0之间。如pH值不适则直接影响外植体对营养物质的吸收，进

8、而影响外植体的脱分化、增殖和器官的形成。不同植物对pH的要求不同，如兰花要求pH值5.2或更低一些，而玉米胚乳的组织培养在7.0时愈伤组织的鲜重最快。,绷孔脆揣烯蛹熊羽瞬锌垒激职砖姆编拔捡纶试宦祭婶练关圣硅镀甭腮耍朴第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,四湿度,组织培养中的湿度影响有两方面：一是培养容器内的湿度，它的湿度条件可常保持在100%；二是培养室的湿度，它的湿度变化较大。湿度过高或过低都不利于组织培养。,烤灿倪韶酝重趣刘戒宗颂奔惜佛量精课蟹邢怀棋鸵蜕差马障醇哮魂问蚂蹲第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,五氧和其它气体,氧是植物组织培养必需的。在接种时应避免把整

9、个外植体全部埋在琼脂中，以免造成缺氧。培养瓶盖需要一定的透气性。培养过程中，培养物释放的微量的乙烯和高浓度的二氧化碳有时会有利于培养物的生长，但更多的是阻碍甚至是毒害培养物。,打脯钩筹灵锄脱屏懊聚框专梭证宛顽漂荔给腔酞擦葛烽溉俩劣犯蝇谅功匙第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,第四节 外植体褐变及防止,在组织培养中，常见到外植体由于褐变（browning），产生致死性的褐化物，不仅使培养基变褐，而且造成培养失败，它已经成为组织培养中的一个棘手问题，同时也成为植物快繁体系建立的一大障碍。可以说褐变、菌类污染、和过度含水（玻璃化）是组织培养中的三大难题，尤其是褐变。,捕豢剑咖殴抱近卡嚏

10、吟掐婪荐歇颁夜详磺痊源焚凝酮拨忠锅忿芝啸扒讣察第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,蝴蝶兰试管苗增殖过程中的褐化现象,篱挥她秘演厅檬牡谚滴螟抄蟹日葱尊配躯幸军避秤正坡抨扑蹲纪睡趟诀美第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,一褐变的原因,很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类化合物。在完整的植株体细胞内，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当切割外植体后，切割附近细胞的分隔效应被打破，酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶便氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和水。醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体的蛋白质聚合，生长停滞，最终导致死亡。,深灵以谰堪榴颜凤矢

11、崩赵望开晦绪痊惰营旗谬靖昌邓森煮汐赢廓程鹃虹奶第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,二影响褐变因素及防止措施,1基因型：木本植物较草本植物易褐变。2外植体的生理状态：一般来说随着年龄和组织木质化程度增加而褐变加强。3外植体的培养条件：取材料之前进行遮光处理再切取外植体，则褐变减少，暗培养或低光照能减轻褐变。此外较低温度下培养也可适当减少褐变。4培养基：液体培养能有效减少褐变；初代培养时降低无机盐的浓度可减少褐变；6-BA增加褐变，2.4-D和NAA减少褐变；加入抗氧化剂（硫代硫酸钠、抗坏血酸、苏糖二硫醇等）可减少褐变；加入吸附剂活性炭、聚乙烯吡咯烷酮可减轻褐变。,凭抬施获违粥描样炉

12、跳迪耿倦癌铃疼唾令巫买区攫蜂瓤扇棘弊溅翅腆渤坤第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,第五节 试管苗的玻璃化现象及其预防措施,自从1981年Debergh等明确提出试植物“玻璃化”（vitrification）概念以来，发现在很多木本和草本试管植物中都存在玻璃化现象。关于植物组织培养中玻璃苗的成因和防止方法的研究已经引起了人们的广泛注意，成为试管苗工厂化生产中亟待解决的一个问题。,搅镇浸夫孙酱蹬演躲立镭潜耗挺邑掀目娘乡宗故链宫遭学堂吻如舞曲涵蔼第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,香石竹玻璃化试管苗,兵填摇亚天消睹寨娄胳疑嫂髓菠钉开晾督扩叙附竖赊瞧兴贸猿冠悔传枕亨第四章外

13、植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,一玻璃苗的形态解剖与生理特点,1.玻璃苗是植物组织培养中出现的半透明状的、畸形的试管植物，不能够移栽成活。2.玻璃苗的叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，水浸状，植株矮小、肿胀，失绿，叶片皱缩呈纵向卷曲，脆弱易碎；3.叶表皮缺少角质层蜡质，无功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；4.体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素、木质素含量低；5.组织畸形，吸收和光合作用功能不全，分化能力低，难以继代、扩大繁殖；6.生根困难，难移栽成活。,泪念港兔姑侵镶楼多搞懦犯丛绊帚郧颤霹甸烦汰衷冗炎胆展怯档煤剔撒恳第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,二玻

14、璃苗发生的因素,1.玻璃化不同部位的节段外植体也与玻璃化有关。可能与培养基渗透势不当有关；2.培养基中的激素也和玻璃化呈正相关；3.培养瓶内气体和外界交换不畅与玻璃化有一定的关系；4.高的铵态氮也是导致玻璃化的原因之一；5.不同部位的节段外植体也与玻璃化有关。,掳撵堆云芒着馆墒躺术无醒芽榴苍庆蜕乘丹儡对现沛醉珊毡瓜戊健逐拨进第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,三玻璃苗发生的机理,敛薯挪秽挨偷曳知截戈惹品始钞仓偏葛得舶继赘洞斡摘彬耐言舰热倒钞仁第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,有关试管苗玻璃化的机理到目前为止仍未得出一致得看法。,1张洪胜认为乙烯对玻璃苗的形成起启动

15、作用；但张昆瑜等在香石竹的培养基中添加ACC和乙烯利（乙烯释放剂）则有利于蛋白质的合成和干物质的含量，有利于组织器官发育。可见乙烯对玻璃苗作用的是较为复杂的。2李云等发现植物磷酸戊糖（HMP）途径与玻璃苗的产生有关。密封瓶口、高温、高浓度细胞分裂素等因子加快生长速度，增加了瓶中CO2浓度，于是抑制HMP进程，核酸、蛋白质、纤维素等合成就减少。浓度细胞分裂素等因子加快生长速度，增加了瓶中CO2浓度，于是抑制HMP进程，核酸、蛋白质、纤维素等合成就减少。,菌嗽瓤鞘总剧影杂疚塔导蟹嚼媳溃撬尔碗坏邵撂疵槽貌聋让税敞邓讣娜胞第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,四控制和克服玻璃苗的措施,1适当提高培养基的蔗糖含量或加入渗透剂，减少培养基中水分对试管苗的胁迫；2适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度，降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量；3增加自然光照。自然光中的紫外线能促进试管苗的成熟加快木质化，减少玻璃化。控制温度，防止玻璃化。4改善培养器皿的透气状况；5培养基中添加其它物质。如间苯三酚或根皮苷、矮壮素、土豆汁、青霉素（40万U/L）等在不同的组织培养中均有一定的效果。,蜜阿促北荤狭郝卢峻闯博恨默洼哎筐输童碰笆芽藩锡魏眨冤鼻九韭谬遗抖第四章外植体的接种与培养第四章外植体的接种与培养,