4第四章柠檬酸谷氨酸发酵机制.ppt
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1、一、柠檬酸简介,柠檬酸又名枸橼酸,学名-羟基丙烷三羧酸,是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸,英文文献俗名citric acid,分子式C6H8O7。无色或白色晶体,无臭,味极酸,易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。,第一节 概述,第四章 柠檬酸发酵机制,铱河剐咎永狭芜筏败具抱汇炊贱枫厘疽澜塔暑刘常窟重沤抿象玛闭俐非翰4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,食品工业:主要作为饮品的酸味剂,用于各种清凉饮料,还有汽水、糖果、饼干、罐头、果酱、果汁等食品的制造。也可用作油脂的抗氧剂;医药工业:是许多医药品的原材料,如柠檬酸哌吡嗪(驱蛔虫药)、柠檬酸铁铵
2、(补血剂)、柠檬酸钠(输血剂)等。此外,柠檬酸还用在许多医药中做酸化剂;化学工业:柠檬酸的酯类可以作为无毒增塑剂,来制造食品包装的塑料薄膜;其它方面,如用于工业、民用的洗涤剂中作为助剂,制造无公害洗涤剂;用在混凝土中作缓凝剂;在电镀中、皮革业、油墨、晒图等工业中也被得到广泛应用。,二、柠檬酸的应用概况,鸳锥贵劲钟腑追绞绘吏赣障草含七嗓撒淳算竭仗怨士想裹淌澳帜滴坟榷良4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,三、我国柠檬酸生产现状,生产状况:60年代开始,生产柠檬酸年总产量居世界第一,出口量一直占国内总产量的50%以上。目前,生产厂家近百家,万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原
3、生物化学集团公司(生产能力为12.0万吨/年)、江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司(生产能力为4.0万吨/年)、安徽华源生物药业有限公司(生产能力为3.5万吨/年)等。存在问题:出口量增长过快,技术创新相对滞后,加上国际市场竞争激烈,已出现严重的供大于求的局面,设备利用率不到60%,行业经济效益呈滑坡态势。,硬抹盯沃挎砧蛇焰彝淤沾狈斟烦盆层摆就袖傻腐埠链屯适彤金结逗等颜臂4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,朔停幻原堰侩佃墟走篇蚌颈横荚堑哭瓷浅落坊内监猎牌缕镰傍乳艺钨泵袍4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控,1940
4、年,Krebs:TCA;1953年,Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶;1954年,Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢;1954-1955年,Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA循环。,一、柠檬酸合成途径的发现,绘抒焚汗墓乔柔弯恩吵胃刹鸯仅肿巩测裤语格挡孺境恫绚卢涣眩澄幽郝基4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径,鄙仅虎芽潭藏肾衍僧厨但忆涯绕震情舆眺压屿腑捆焊勘筛同幻婿欺馋渴掘4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是,葡萄糖经EMP、HMP途径
5、降解生成丙酮酸,丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA,另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸,草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。,(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径,前者EMP:HMP=2:1,后者EMP:HMP=4:1,(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环,在以糖质原料发酵,当柠檬酸积累时,TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。,(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱,草酰乙酸是由丙酮酸(PYR)或磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系,其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。,山厅拂厦汉威遂霖兹毋此靡异蕉庚黎卧傈破揍旅印身歌短
6、扎诉纬斜雌普豆4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制,尹汞牢必拢规窍婴亲叉菜博洗睹回鄂汾颠僻锯揽棉溃瓤花旋纳非赢境监简4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,1、磷酸果糖激酶(PFK):,(一)糖酵解及丙酮酸代谢的调节,Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响,Mn2+缺乏为何会使NH4+浓度升高呢?,当培养基中Mn2+缺乏时,微生物体内积累几种氨基酸(GA、GLu、Arg、Gln等),这些氨基酸的积累,意味着体内蛋白质的合成受阻,而外源蛋白质的分解速度则不受到影响,这样NH4+的消耗下降,NH4+浓度就会升高。,恿披镜卵嘎
7、肩秩疏秋渤习块厘稳贪剧败熄棉吱燃萎此挛觅俏痊炽臻欺沥笑4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,磷酸果糖激酶(PFK)的调节,柠檬酸和ATP对该酶有抑制,生产菌需要解除该抑制作用,AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用,NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制,故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量,Mn2+的影响:,Mn2+缺乏,菌体的TCA酶活下降,Mn2+缺乏,可能干扰蛋白质合成,导致蛋白质分解,NH4+水平升高,减少柠檬酸对该酶的抑制,靛皱丑鸿荫粮巴称售司鞍司拎俘刽廊盗盗涟郑睬鲁妥藩习裴汐军避黄屎劈4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,2
8、、CO2固定反应,通过 CO2固定反应提供C4二羧酸(1)磷酸烯醇式丙酮酸+CO2=草酰乙酸(C4二羧酸)酶:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(2)丙酮酸+CO2=草酰乙酸(C4二羧酸)酶:丙酮酸羧化酶 以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。草酰乙酸的积累利于加速柠檬酸合成,粒掂界障赊贺讼邱茅抚炬娶庄柬抑鹃有吴裂希袱碑验挥鄙宰蔡茹阔税镰骚4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,(二)三羧酸循环的调节,1、柠檬酸合成酶的调节:柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。,2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节:,顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异
9、柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时,这3种酶均存在(组成酶);而控制铜离子0.3mg/L,铁离子2mg/L和pH2.0情况下,这3种酶均不出现活力。,顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸可逆反应。研究表明,黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶,它在催化时能建立下面的平衡:柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸90:3:7。铁为顺乌头酸酶的激活剂,,子涂韶基隐窍栏墅患摘启刁脓点沉芍裸队态氧嫁哨咆笺簇蒋充锚硫现轮蜒4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,3、-酮戊二酸脱氢酶的调节,在黑曲霉柠檬酸产生菌中,TCA循环的一个显著特点是,-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子
10、的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时,在柠檬酸生成期,菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。,-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应,一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失,就会引起:TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成,使TCA循环成“马蹄形”。-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。,健般倡函隶削河禁紊切滋妈甫达交凌蝎河瀑取匠胎罩阳彭希拙鸟殴盲灼邪4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,菌体要大量合成柠檬酸,从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通,在这个过程中:丙酮酸氧化脱羧,每分子丙酮酸可产生一分子的NADH,在有氧的条件下,每分子的
11、NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O,并氧化磷酸化产生3分子的ATP,造成了微生物体内能荷的增加,能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性,使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止。,(三)能荷调节对柠檬酸发酵的影响,如果NADH(还原型)不能够快速的被氧化转变成NAD(氧化型),则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止,仍然不能够合成柠檬酸。,柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸,也就是说,NADH即被氧化了,又没有产生ATP。,枷坛汪傈急丫送反予紊书倘鹰焕掩签利崖博邪谤呼燃谤瘴横境烙匣坚权碘4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,解偶联剂(uncoupler),使
12、氧化和磷酸化脱偶联,氧化仍可以进行,而磷酸化不能进行,解偶联剂为离子载体或通道,能增大线粒体内膜对H+的通透性,消除H+梯度,因而无ATP生成,使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。常用解偶联剂主要有:质子载体:2,4-二硝基酚(DNP),羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。质子通道:增温素(thermogenin)。其它离子载体:如缬氨霉素。某些药物:如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联,从而使体温升高。,蔽曾批搁被膀耳硫回鸡陆骸缸朽逮尹买探烯烈捏钙舷农痪边阐挎滚旺狄胜4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,一种假设:该菌体内存在一条侧系呼吸链,NAD(P)
13、H经过该呼吸链,可以正常的传递H+,将其氧化为H2O,但是并没有氧化磷酸化生成ATP;能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。,实验证明,在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链,该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧,如在柠檬酸的发酵中,发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间,或中断供氧一段时间(20分钟),则这一侧系呼吸链不可逆的失活,其结果是菌体不再产酸,而是产生了大量的菌体。,辱藻深奠仲冷捻胸绷苛紧檀凭脐汐气兄获亢极酵惕镶秉娩筛穗俱便毒好榜4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,(四)乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸,丙酮酸脱羧反应是不可逆的,存在异柠檬酸裂解酶,草酰乙酸的供给只能
14、由乙醛酸循环来完成,3醋酸 1柠檬酸生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸顺乌头酸水合酶催化反应平衡为:柠檬酸:异柠檬酸:顺乌头酸=90:7:3。细胞质中积累大量异柠檬酸。,粒澜宫巢店咆绸镐卞侩植韵命瞅拘魁覆骤扯询葛幕离誓刷匀刁卜戴泄钡休4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4+,有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链:解除磷酸果糖激酶的代谢调节,促进EMP途径畅通。丙酮酸羧化酶是组成型酶,不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡,以及柠檬酸合成酶不被调节,增强了合成柠檬酸的能力。,小结:,顺乌头酸水合酶在催化时建立了
15、以下平衡:柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸=90:3:7 同时控制Fe2+含量时,顺乌头酸酶活力降低,使柠檬酸积累。随着柠檬酸积累,pH降低到一定程度时,使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利于柠檬酸的积累。,娶串弘堪凶缝仙修付灰们贤乔熬醋蚌坑流裸如淋钙朵勃令验春顺管膨熄捕4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,(五)柠檬酸发酵的产率,1、无CO2固定反应的产率,合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A,也就是需要1.5分子的葡萄糖。,理论产率为:192/(1801.5)=71.1%,坪栏遵沸仍答纺俭仅壹畏檄讯暑剁至驱畜柬从煽蹲娥榜歼膨歌驴煤黎姑津4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4
16、第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸,晴旱剖埔侠噬炒帧鬼奈釜淀南郡懒己谆扒脐俭础豺搐够记湃荫释人苔币此4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,四、柠檬酸发酵过程的控制要点,(1)控制Mn2+、NH4+浓度,解除柠檬酸对PFK的抑制,使EMP畅通无阻。,(4)控制培养基中的Fe2+的浓度及产酸发酵的pH,使顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶失活。,(2)控制溶氧,防止侧系呼吸链失活。,(3)筛选丙酮酸羧化酶高活性菌株,培养基生物素含量充足,提高CO2固定合成草酰乙酸能力,迸码冈了能看焙烫韩威恤垃梢鞋撤炎盂唁撬宠专远盟晾头续犀僧拙多徒竞4第四章柠檬
17、酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,柠檬酸发酵中,三个控制点,恐眶铀身臃偏售翅尖仿躯牙村砂雷础斌羽篱梅开捧贱俏旬至碧采胎委型澜4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,五、柠檬酸产生菌育种的传统方法:,1.透明圈大的菌株 平板:10%甘薯+2%的琼脂+0.5%CaCO3 诱变后,涂布,透明圈大的则好 2.显色圈大小 平板:麦汁培养基+pH值指示剂 诱变后,33培养3天,变色圈大的则好。,响记窿屿丙版装沙程匡刘翔走凸黄班誊拎丹早峻灶呆鹅塌腔杂阳霸厘痕能4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,3.不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株,
18、说明其TCA循环中柠檬酸后续酶的活性较低,或者丧失,这有利于积累柠檬酸。方法:以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。4.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸,自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低,这样不利于孢子的形成。(中间产物少,C架少,不利于合成代谢,不利于孢子的形成),绽甭忘播栖率做诗气评墟伟显首炔面煤雨译蹭釉袒财鹰越犊脖汛球撇嘉滥4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,第五章 氨基酸发酵机制(谷氨酸发酵),丝恼堰登耘峰桑史迁尺爽衫混吵尤汁芹庞石窟惑娜勘不然瓷来菊瞬虎迄判4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬
19、酸、谷氨酸发酵机制,一、概 述,在食品工业上的应用。甘氨酸、丙氨酸具有甜味,天冬氨酸、谷氨酸具有酸味,谷氨酸钠、天冬氨酸钠具有鲜味,可用作食品添加剂。蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸目前作为饲料添加剂。在医药工业上的应用。氨基酸的混合液可供病人注射用,氨基酸的混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。精氨酸药物用于治疗由氨中毒造成的肝昏迷;丝氨酸药物用作疲劳回复剂;蛋氨酸、胱氨酸用于治疗脂肪肝;L谷氨酸与L谷氨酰胺用于治疗脑出血后的记忆力障碍等。在化妆品生产中的应用。氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似,具有调节皮肤pH和保护皮肤的功能。胱氨酸用于护发素中,丝氨酸用于面霜中。谷氨酸、甘氨酸
20、、丙氨酸与脂肪酸形成的表面活性剂,具有清洗、抗菌等功能,用于护肤品、洗发剂。在农业上的应用。一些氨基酸在体外并无杀菌功能,但能干扰植物与病原菌之间的生化关系,使植物的代谢及抗病能力发生变化,从而达到抑菌的目的。苯丙氨酸和丙氨酸可用于治疗苹果疮痂病。用甘氨酸制成了除草剂,易被微生物分解,不会造成环境污染。,凑酬头涸给淄砾鞍栋胶设种阉疵卓瘤朔乡译呜仪但谜伴壁拜淡事且只歹乞4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,氨基酸的制备方法,发酵法:发酵法又可分为直接发酵法与添加前体的发酵法。添加前体法是以氨基酸的中间产物为原料,用微生物法转化为相应的氨基酸。提取法:将蛋白质原料用酸水解,
21、然后从水解液中提取氨基酸。目前,胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生产。酶法:利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。合成法:用化学合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸,甘氨酸和苯丙氨酸。,莽胁逗宦梨慷锐澈亮脚届握迫读淹蔓一惹晤如驾蛊退玩玲殃瓢裴几如代镍4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,二、氨基酸的发酵生产,氨基酸本身的合成在不同生物体中,有较大的差异,然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族:谷氨酸族(-酮戊二酸族)包括:谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸;丙酮酸族 包括:丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸
22、;天冬氨酸族(草酰乙酸族)包括:天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸;磷酸甘油酸族 包括:甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸;芳香族 包括:苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸;组氨酸 合成为单独的一条途径。,荷玖惯嫩拓翅泼鞋巳辕舍棱网葱格陕唇到称瞄洞秉仇殆料测泵蛔编墙脾吏4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,镇眉弓喷鞘仙禾斌纲蛾习滨校境犁浙峭胯癸样沙熟衣非蝇蹭掣嘘奄贸卫斤4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,部分氨基酸及其生产所用菌株,相勤塞隆铰郸凿据顿随笨羞攘实宙篮瀑酶辞肮舟怖涉郸脖崭惯咸吟肮几必4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,氨基酸
23、发酵是典型的代谢控制发酵 氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物氨基酸,都是微生物的中间代谢产物,它的积累的关键是取决于是否能打破微生物的正常代谢调节。,控制旁路代谢降低反馈作用物的浓度:控制反馈作用物浓度是克服反馈抑制和阻遏,使氨基酸的生物合成反应能顺利进行的一种手段消除终产物的反馈抑制与阻遏:通过使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法来进行控制细胞渗透性控制发酵环境促进ATP的积累,以利于氨基酸的生物合成,咒坪寡被原兹缮撒斜炽哮艰霸浩铣腐席懊火迢码削筐召册媚珍矗漓横馆缅4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,D-苏氨酸,L-苏氨酸,-酮基丁酸,L-异亮氨酸,L
24、-苏氨酸脱氢酶,反馈抑制,D-苏氨酸脱氢酶,男倘讨耍劲跃深块抢僵妆堵墅嫁衬梦扫菌览菲手庞格磋鉴豺坏祭久午氦正4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,谷氨酸,N-乙酰谷氨酸,N-乙酰-谷氨酰磷酸,N-乙酰谷氨酸-半醛,N-乙酰鸟氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸,精胺琥珀酸,精氨酸,负反馈控制,N-乙酰谷氨酸激酶,Arg-,天冬氨酸,天冬氨酰胺磷酸,天冬氨酸半缩醛,高丝氨酸,苏氨酸,赖氨酸,天冬氨酸激酶,协同反馈抑制,须溪让群何窍责润金阎攀震萤碰像肮储拧匙叼拒链繁捌肾楚卢堵寅秆雁闷4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制,谷氨酸产生菌因环境条件变化而引起的发酵转换,乳
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