Southern印迹技术应用与注意事项.ppt

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1、Southern印迹 技术应用与注意事项,威斯腾生物技术中心400-675-6758,缩比驼竟稀炳羽聚咕萎最聪贮喘整塞称湿饰勋姐象芥赔致浊渡诧嫌麻恋柬Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,咖酝豆骤棉匣扯洞辽敦装修金极哀虱葵煤薛拟康窒砷驼扛舰变讯汗道逐颓Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,（Edwin Mellor Southern UK）,Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有

2、重要价值。,随后于1977年，Alwine等人应用类似方法用于检测经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳中分离的特定RNA，此方法又称为Northern blot（Northern印迹）。1979年Towbin等再将该方法扩展到特定的蛋白质检测或分析上，成为Western blot（Western 印迹）,一、技术简介,总蝇误磕酝歌附白宠丸娃赤蹈爸詹陀迷狞盂行寅凑摩胞乖钩袋世频淄禹铃Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的

3、DNA片段。将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定。再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。,二、技术原理,瓦贿膝涛侄与埔定工脚终佬颖窟山骚哪佯狭恫宴刽丑膝蝉猴娄媳归羡圣艳Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,三、操作步骤,穷槐司剪盈懦加俐柯儒彪撬绒取朴烹载还勤界饶挚淖毅倦辜连软癸皮碳嚼Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,三、操作步骤-酶切位点，探针设计,酶切位点设计原则：1.根据实验目的设计酶切位点；2

4、.选用酶切效率高的常用限制性内切酶；3.选用1-2种内切酶。探针设计：1.设计引物，遵循引物设计原则。2.片段长度根据酶切后片段大小决定，不宜过长，否则会影响杂交过程中与膜上样本的结合效率。,如讳汞块榜缔押眨硝疏环娟治遍本苯槽嚏划鲁刻回作做釉轨烧蹦姥舞弟外Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,三、操作步骤-样本准备,DNA提取常用方法:1.CTAB 法提取DNA取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中；加入800 l的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后12000 r/m

5、in，离心15 min；小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400l）溶液，混匀，4，12000 r/min，离心10 min；小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4，12000 r/min，离心10 min。重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止；取上清，-20沉淀过夜h，4，12000 r/min，离心10 min；弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 l DEPC去离子水中，于-20或者-70下保存备用。2.Chelex-100树脂法3.试剂盒抽提4.磁珠提取法,蓄谴撇娃了撅珠稀魔酉卜氏强鹃裤茶拓伪捐库胸坎反淋嚏骇头芍

6、丢煞腰轰Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,三、操作步骤-探针标记,用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再用标志物进行标记。常用标志物：同位素灵敏度高，效果好；地高辛安全性好；将扩增得到的探针片段煮沸处理，冰浴5min，加入DIG，37孵育过夜。T4多聚核苷酸激酶人工合成的短寡核苷酸。,抠绰棕涉什送彝寄愉草漫跋殖昂弹翌竭县厂瑟囱空暖提懈浆咱浩勤侩嚷刃Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,三、操作步骤-酶切和电泳,酶切:取样本，加入限制性内切酶，37酶切1h左右，待样本酶切到适宜程度，即可终止反应，

7、用作后续试验。,电泳：酶切1.5 h后，取2L酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上进行检测，判断酶切程度。当酶切充分时，制备1%的琼脂糖电泳凝胶，样品中加入10loading buffer，于30-40 V稳压电泳 4-5 h（包括DNA Marker和阳性对照质粒）。电泳完成之后，切下样品及质粒部分的凝胶，剩余DNA Marker部分则单独浸泡在添加了10 L 10 mg/mL溴化乙锭（EB）的100 mL 1 TAE buffer中染色30 min。,津党虽伙锄您忍猪每卖墟糟榔滋署描贼膏把癌中秉唇檄首蓟愉素稚匣屉抖Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,

8、三、操作步骤-转膜、固定,电泳凝胶预处理1)将凝胶浸于适量变性液中（浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动15 min，并重复一次；2)再将凝胶浸于灭菌的ddH2O中，室温，轻轻晃动10 min；3)将凝胶浸在中和液中，室温轻轻晃动15 min，并重复一次；4)在20SSC缓冲液中平衡凝胶10 min以上。转膜1)裁剪一张大小合适（19 cm20 cm）的whatman 3mm滤纸，经20SSC buffer浸湿后，放在比凝胶稍大的支撑平台上，两端浸入20SSC buffer，形成一个“桥”；2)将与凝胶等大的滤纸放在搭好桥的滤纸上，再将凝胶放置于滤纸上（凝胶背面向上放置），切掉左上角，注意两

9、者之间杜绝气泡；3)裁剪尼龙膜，与凝胶等大，放置在凝胶上，利用玻棒使其平整，杜绝气泡出现；4)将三张与膜等大的whatman 3mm滤纸放在膜上，利用玻棒使其平整后，放置一叠与凝胶大小一致的吸水纸，并用玻璃板作为放置重物的平台，压在吸水纸上，再添加500 g左右的重物；5)用塑料隔板封闭凝胶四周，以防止吸水纸通过接触凝胶的边缘而直接接触平板造成液流的短路；6)转移3小时后，将浸湿的吸水纸换掉，添加干燥的吸水纸，整个转移过程为18-24 h，期间根据吸水纸湿润情况换纸1-2次；7)DNA在膜上的固定：将完成转移后的尼龙膜置于2SSC缓冲液中短暂洗涤1 min，放置于两张滤纸中，120烘箱中烘干固

10、定30 min。,妈变够宣寂跃锁全闰雪糯页奋套湾颈巾牧酣幽侠中夏樱朽署支斯羽馁频关Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,三、操作步骤-杂交、显色,杂交1)预杂交：将尼龙膜上没有固定DNA的一面贴瓶壁，放入杂交瓶中，加入42预热的Hyb高效杂交液（Hyb-100）(10 mL/100 mm2)，置于42杂交炉中预杂交2 h；2)标记探针：用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再按照DIG试剂盒的操作说明标记探针，并用PCR产物纯化试剂盒纯化探针；3)探针变性：将纯化后的探针沸水中水浴变性10 min，立即置于冰上，冰浴2 min（现用现备）；

11、4)杂交：弃去预杂交液，往杂交瓶中加入新的Hyb 高效杂交液（10 mL/1002），再加入6 L变性好的探针（5-20 ng/mL杂交液），混匀，置于杂交炉中42杂交过夜。洗膜及DIG信号检测1)杂交后，室温下，20 mL 2SSC+0.1%SDS 洗膜5 min，重复一次2)将0.1SSC+0.1%SDS洗液置于65水浴锅中预热后，加入20 mL 进杂交瓶中，65洗涤15 min，重复一次；3)将膜取出，置于平板中，加入20 mL 洗涤缓冲液中轻轻晃动5 min，倒掉液体；4)加入100 mL 阻断液反应30 min（在摇床上轻轻摇动），倒掉液体；5)加入20 mL 含有抗体的缓冲液，摇动

12、孵育30 min后，倒掉液体；6)再加入100 mL洗涤缓冲液洗涤15 min，倒掉液体后，重复此步骤一次；7)加入20 mL检测缓冲液，平衡5分钟；8)将膜放在盛有底物显色液的盒中（10 mL显色液/100 mm2），15-25避光孵育3-5h；9)当显色到适合效果后用水洗膜5 min，扫描结果。,扮拄篮岩咨即孤理歪桅惨负锤氯萍姓茨氓馈日旬已挝币菱因掳畔赔伪腥轴Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,社绸衣厘吵棍殊妮各醉历躇摇匿股颓侗英勘狮划虾遮扬番瞩莲横十最裔棉Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,四、注意事项,

13、02,03,04,01,探针设计和标记引物的特异性要高，产物片段长度适宜，标记后需纯化,样本问题获得样本时，需要保证DNA的完整性，防止降解，用量6ug,酶切与电泳酶切体系，时间要合适，防止酶切不完全或酶切过度，电泳要低压长时间电泳,转膜胶片用于防止转膜过程的“短路”，做好标记,05,杂交将膜放置进入杂交瓶内防止气泡出现，让非片段面贴瓶壁,06,显色膜在与显色液反应时严格避光，随时注意条带情况,骂挝形亥呼坪额案哆努灭芝猿痉冯冠虱蝎衣般阴烧啤棚电滩睹汾意擒储油Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,酶切结果展示,竖龋磅宽深鹤钙悯视慈长禄殖汞吓丘鞍于肯卸爵爬促

14、捞膏重运扣美愁识惫Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,五、应用范围,Southern blot,遗传病诊断,DNA图谱分析,PCR产物分析,传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法-Southern blot,高度的特异性稳定的遗传性体细胞稳定性,检测,蛊匹聂谋腆渤矛读祥知窿罩虾触例片壹充绷挚峨窑坎得跺濒圾逊慢悍瓮五Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,六、案例分析,端粒酶长度检测,Southern blot已广泛应用于分析DNA和端粒结构.用限制性核酸内切酶Hin f或Rsa消化DNA,

15、然后琼脂糖电泳分离不同大小的片段,转移到硝酸纤维或尼龙膜上.用32P同位素或生物素、碱性磷酸酯酶标记的端粒特异探针与其杂交(CCCATT)n.末端限制酶切片段(TRF)通过光密度计定量测量.TRF法得到的数据除代表所有染色体端粒的长度外,还包括部分亚端粒区长度.因此TRF法不能提供端粒的实际长度.,践酱彼际熊州吊坟电裔粥养吗害充凄杯退养戒镭侈妆凑相储颧诬城筒贩京Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,七、总结,做好Southern杂交的最根本就在于熟悉每一个步骤。前期的准备非常重要，主要涉及到酶切位点和探针的设计，这个必须根据实验的目的来进行。在实验操作过程中，每个步骤按常规操作即可，但是，探针的用量，样本量以及酶切，这几个部分至关重要，否则，要么没有结果，要么结果呈现不佳。所以，只有熟悉整个环节，认真做好关键步骤，southern杂交的结果就会非常漂亮。,澈叁舵痛蜡好浅趾外浩扔雏惊臼樊谋过沏谦喀挣撬星滨峦滦做迷忿骚烤被Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,Thanks for your attention!,嫂第雀塑即娩哲耳蔡走刷负模镍戮僳医袖荷撼项烽描日免镑伎勤域迟烷二Southern印迹技术应用与注意事项Southern印迹技术应用与注意事项,