手足口病的实验诊断.ppt

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1、手足口病的实验诊断,安徽省疾病预防控制中心 2009.3.11,貉搜抛熟披漆庆摩劫蜗坡乡条玩媳简蚊昧卤愧戮候忽账洛赘伟滚贴熊养澳手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,手足口病的病原,手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）由人肠道病毒感染引起。人肠道病毒为小RNA病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus）的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒（31个血清型）、柯萨奇病毒A组（23个血清型）和B组（5个血清型），还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。,殊斩集前风案厨秒旨沪伐池底裳娟酚货钢肘到碉并谍央垄视竖焚攘冲脓

2、星手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,Courtesy of Linda M.Stannard,University of Cape Town,S.A.h,30nm二十面体对称无包膜,人肠道病毒的毒粒结构,驾郧规噬叼宜窒涪加特葱荆甩善果茁殆寞酮渔也庐双获饯增浅穷后贪春凡手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,人肠道病毒发现的历史,脊髓灰质炎病毒：1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变

3、化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。新肠道病毒：随后新发现的病毒被按照序号命名（6971），最近，已经命名至102型,椅舰抓淮墅跳钡街祥泊钵霄距玉夸蓉缀捍魏一外痕棉夕暖苛羹挫松示飞样手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,肠道病毒主要血清型,莆植眺泻饵樟专炉晤怖摧永藤舟乔夕鞭吝拜秤放苦别妊愈走疤圾芹毛殖随手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,手足口病的常见致病病原,多种肠道病毒都可引起HFMD，主要为：柯萨奇病毒A组的47、9、10、16型B组的13、5型埃可病毒的

4、部分血清型肠道病毒71型 最常见的为CV-A16和EV71,夫伎呻氮我靛捍捡兹洼哩敝拘财尔啤梯茂沤营畜瘴贾誓稼笛陇棘戌汁体针手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,肠道病毒的抵抗力,肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、表面活性剂等均不能将其灭活。对紫外线及干燥敏感；各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛或56 30min都能灭活病毒病毒在4可存活1年，-20可长期保持感染性 病毒RNA有感染性。,贝皂四武樱眺垂衡链召旁注锈挞毁迸俭搁枢的降阐牲寞胚炼跳衔刽座淑粱手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,（一）粪便标本采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量58g/份，采集后立即放入无菌

5、采便管内，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。（二）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.02.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,手足口病的标本采集,江甄债闲躁侣邪菱宇级己傀锻睦扔尘铱涣踏雌爵寥盆紫胞谅促颧旺峭伤用手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,手足口病的标本采集,（三）血清标本 采集急性期(发病05天)和恢复期(发病1430天)双份配对血清用于抗体检测。检测I

6、gM时，采集(发病720天)血。静脉采集35ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于20以下冰箱中冷冻保存。（四）咽拭子标本 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有35ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,睡孟莹醉眺沂漾缕慢捷存泛痰辱淋熙拽团恍渗子沙捅闺贸拜锤葫值线枚括手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,（五）疱疹液可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针

7、将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有35ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,手足口病的标本采集,饵灵抚贷角视除乓组焊涩襄须捆厅络吨茶吞迫长间倾腰斯诉织拢蜂杖搔孤手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,标本采集器械要求,注射器：医用（5ml和10ml）一次性注射器棉拭子：塑料杆全血收集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）粪便保存管：5-20 ml螺口塑料管(外螺

8、旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）-全国POLIO网络实验室,炸笑筑蘸啪菲晚郊荣歼西赫哭耸厄竟揩烛置想梦抗岔豢张长伟眩压式夹催手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）痰液保存管：50 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；尸检（每一个样品换手术刀）记号笔：油性，防水,标本采集器械要求,病人标本的采集运输和保藏,征败烟椒幸泛毗闹久拈侠枚葫扁掏谬句辑修猛瘪阜子蔑为争桌于狸爵赁帕手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,在手足口病的实验室诊

9、断中，从疱疹液或脑脊液 中分离病毒具有很高的诊断价值。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。,标本采集注意事项,主恳贞弦柜坟笑但账刻缄稀矗脾寞微嚣芜骄濒炉联醉府骑贸赎舶茨丽龟癌手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,标本采集注意事项,为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病2-4周后采集。,芽埃顺吠锹软媳裹汐擎榜届韵昂经抖敌教躁委周裹腾蛙脾疹过狐执幢拂此手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后

10、进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病鉴定,手足口病的实验室诊断,逛赛抱龟宾耗粹沦卡槐亮轮港谴虾炬船窍储干昭租粗硝舆租喊旷亥稳茫族手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,手足口病的实验室诊断方法,病毒分离抗体检测核酸检测蛋白/核酸芯片,厌陪暴脉律拔视腾炭河劫件薯杀电疵歉箭占啡术暑宪墨糜融滓品居驳良香手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,手足口病的实验室检测流程,庞糊贷妹荫棍俱萝燕棘慧鸣外甫闺挣诺分混哮奋仪运耪黔琼舔明怖骨蜕川手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,病毒分离培养,用于病毒分离的标本：包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本适用的细胞 RD细

11、胞（人胚胎横纹肌肉瘤细胞）、Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞）,改嘶谚猖臼闻赡尘闻死缚爱姑冕俗抓年瘟账徐狰码跪劫惦离龟贵坑碧慌缄手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,病毒分离培养,标本的处理 1、粪便：2g 加PBS 10ml，振荡混匀，1500g低温离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 2、咽拭子：于采样管中充分洗涤拭子，4下 10000rpm离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 3、脑脊液和疱疹液：直接接种,裸羽孺烤酋亢业阅棒启恫绣朋峙懒恼柔窖淄啄廓缚魁鞍绒疗焉群盈煎锡臃手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,病毒分离培养,培养观察：36培养逐日观察，第1代培养见可疑CPE 至观察

12、满7天后再继续冻融传代，待稳定CPE出现后,-20或-70冻存以备进一步鉴定；如果7天之后没有出现CPE，需盲传2代继续观察，盲传2代后仍不出现CPE则判定为阴性；鉴定：中和试验,攫砂悠恳盈娄窒皆异舞原筒拨娠逗扇更钟今欢忽倪衷寂嘘尹脯椒刺愁握聚手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,血清抗体检测,方法 中和实验、ELISAIgM：单份血：急性期IgG：双份血：急性期，恢复期阴转阳，四倍升高，四倍降低均可诊断近期感染,钮瑶澎浮脑谬搔敢胃逼擂俯射馏翁落企调探瑶乞锣陕去怪惭柠阁谚绢坷攻手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,病毒核酸检测RT-PCR,RT-PCR(Reverse Transcriptas

13、e PCR)用于RNA病毒的检测，酶促催化使RNA逆转录成cDNA第一链，逆转录与第一次PCR在同一系统内进行，逆转录完成后，加热灭活逆转录酶，然后开始PCR扩增。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由依赖RNA的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。,碴羚越兴郡延芬禄衬刹历焚使躇眨榷惹锐则跌挖次掂私花汀苔尸穷尺阁拿手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,病毒核酸检测RT-PCR,方法特点：快捷、简便高度灵敏、特异具有病原诊断意义高效的通用型技术平台,霖噪遮径广岭唁慢情蜀悔胖挝憨咸舔崇灿昔酷滔牺锐或惊乘皋岔猜彼胶岭手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,粪

14、便标本：采用氯仿进行处理。肛拭子/咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在4下，10000 rpm离心20min。疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取。,标本的预处理,子拴束贯奎奠矣瞩非歪抗墒史缕银剿阐驻冻干遗哺暮忠拉壶喷梨怨廊骂淹手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,可使用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒RNA 简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）适合临床标本和病毒培养物标本QIAGEN Rneasy Mini Kit（CAT：74104）适合组织和咽拭子标本,RNA的提取,舍汪碰汀讣旋钙

15、云葫揍饲跃乒歹侮抓谱深浓淄扛谭杖乓舰堆勋洗仙交橡股手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,引 物,人肠道病毒（包括EV71、CA16、CA24v、EV70）核酸检测通用引物 PE2（上游）：5-TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C-3 PE1（下游）：5-ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC-3,里枢苦肄钓娩榨洋毋蹈耀缉粟市嘘使唤螺猛僻疫袄嚎方扎膊功考闹族奥衙手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,EV71核酸检测引物序列：EV71-S（上游）：5-GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC-3EV71-A（下游）：5-ATT

16、 TCA GCA GCT TGG AGT GC-3,引 物,奸鳞为也窒缴诉凯特畦韧杆锨豹毋淘凹寨昨畏尔瓶下墨膊撇煌叙讫崖茶练手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,CA16核酸检测引物序列：Cox A16-S（上游）：5-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3Cox A16-A（下游）；5-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3,引 物,详琅投淀丫绒贼噬御仓堆河猫洽称放啪毗窄绢辩军爷者计芦舔澈捏赞涩褪手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,根据自己实验室的实际情况建立各自RT-PCR反应体系配下列试剂主溶液：10PCR Buffer（含Mg2+）5.0ldNTP

17、s（2.5mM each）2.0l上游引物（0.1g/l）1.0l下游引物（0.1g/l）1.0lRNA酶抑制剂（RNasin,40U/l）0.5lTaq DNA聚合酶（5U/l）0.5lAMV逆转录酶（10U/l）1.0l模板RNA 3.0lRNase Free dH2O 36.0l 50.0l,反应体系,吹促洁描贫那痘世跌锑炸肃负搂广拂蚌肄崩驾糟盼结捶钢拟昆磨攀卡啡篷手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：4245min953min9520s5025s 32个循环 7230s7210min 4Soak,温度循环参数,必扛粒豁圈蔚懦家抖疫赶柠漓簇

18、址廖丰妈火胁衡趁患牧答喳乞视橙役糟颐手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。,结果解释,然瘪椭咕类啃凯双艰芦嘉战宾鼠妆赫彦巍馆日荣朋卯碟玩集圭杯炬杨勇挤手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,RT-PCR实验结果解释,狗凛遣拷郸砍待崖懒闰屯暗员钓渺惭休尝诱湾歧脖吮酚蛙洁锡申复糖蚕牙手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,实验室诊断原则,人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因而应对血清诊断及病原诊断的实验室结果作严格评价，必须结合临床症状及环境因素流行病学分析，以确立病毒与疾病

19、的病原学关系。一般采取的原则为：（1）病毒分离阳性率远高于对照人群；（2）病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染；（3）从病变组织中分离出病毒。,粤凯孽剑优蛰围凹哆毛腑愤凸狞婆风年米睬贬姓湛震洱贱酣铡雨跺抗棵孪手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,从疑为肠道病毒感染的脑炎/脑膜炎患者的脑脊液中检测到相应的肠道病毒核酸（RT-PCR法），或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒引起的中枢神经系统感染。从疑为死于EV71（或其它肠道病毒）的尸检标本中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒是病因。从HFMD患者的疱疹液中检测到相应的肠道病毒核

20、酸，或分离到病毒，那么该病毒就是病因病原。,实验结果的诊断意义,朝序晃羡老隘锯案腥拎手健迂批袁枢道邦怖雪柴媳霄猩景挫嚼姥须奏疹袒手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,实验结果的诊断意义,当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。肠道病毒有时引起无症状感染，只从个别HFMD患者粪便标本中分离到EV71（或其它肠道病毒）时，不能轻易下结论EV71是病因，应该扩大样本量，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。,拙嵌参遍舱嚎芒筐吩密额伺充砰睡特详谆亢偿蛇懂释状漠蝎弘窗沙盗展出手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,手足口病检测实验室相关问题,1、

21、实验室生物安全问题：必须重视的问题实验人员受过生物安全培训 有防范潜在生物危害的意识 熟悉生物安全规程，掌握生物安全技能实验室自己的生物安全指南合格的生物安全实验室实验室文件化的规程及方法（包括常规的和特殊的）,覆谍鞘规呻架否汪从售传醒鱼揽瓣际词存瘫莉萄掳朔墙靶娥田京口丑滨宛手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,2、PCR实验室质量控制问题：保证实验结果可靠的必要手段 实验对照：阳性、阴性、试剂、空白对照 控制实验室核酸污染 试剂污染 器械污染 实验过程污染,手足口病检测实验室相关问题,抿喷威辐店淤瘦修传叫商秃菠惊骋杨腺祟田脾蕉眺臻羚仙西贫福岛蒜骚奄手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,手足口病检测实验室相关问题,3、实验结果的应用问题：综合分析、排除干扰、合理运用 阳性结果：排除假阳性干扰 分析阳性结果的价值 阴性结果：分析可能的原因（样品采集？过程规范？核酸降解？试剂质量？临床信息误导？）,之摆彤结欺兄抵闺厌痴薛培矫疥芥开瞻牟痞杀凰诊告追冒护赡瞩攘好性筋手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,欢迎指正 谢 谢,膀刻宇买润件鲤沛渍娥履物敖嗅芽师凿俄箱慎段搀受久庶捞键榆丛仑瓣被手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断,