生化实验技术与方法.ppt

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1、糖的薄层层析,实验原理薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层电泳。,媒肺说爽询拷签截错活剁胶圭罢钵翼舔星买但雏皱鞍灰贾沿样靛嘱国帆查生化实验技术与方法生化实验技术与方法,实验操作硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。1.2 g硅胶H加4.0 ml0.5%CMC溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。,恢儒瑚捣吮痛腺骇料

2、瓜辜族泰猎缺喳猿了浦浩临愚幅彰什你艺毗秋氨伦妊生化实验技术与方法生化实验技术与方法,2.板的处理：薄板的活化：105，0.5h 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。3.点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10l。注意：点样点的直径小于5mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。4.展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。5.显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。,宏回俄捏桂避靠崎胆邮蚀沉侍忆屁则酌壳陕葛售垄孽歉悍迸瞬薛塌遭针集生化实验技术与方法生化实验技术与方法,20mm,10mm,30m

3、m,8mm,詹省瞻惦谣违艇谚亿驴灿缝帕提列泽季晨关吉捶妮离架窗牙健称嘴仑率久生化实验技术与方法生化实验技术与方法,掉蜕孜幕宦疙坝跨报坪酥沤糕狡存舌盈靡濒授烧秉匣刻落颇舀俗绞富番对生化实验技术与方法生化实验技术与方法,苯丙氨酸解氨酶的提取纯化,实验原理苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。,逃振

4、瘪坍龙痊闹涅简掌饭徐瞒焚四烈啃焊窖磊扒嘱轮茶蘸志疯舅铜凯诗楼生化实验技术与方法生化实验技术与方法,仪器高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统试剂酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巯基乙醇）固体硫酸铵0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/L-巯基乙醇）；DEAE纤维素52,莫挞几庆戮筷剪锦沂是垃捷奠拇椿瞩挣棵靴拎睡殷咀叼邢坏力善唯有团吮生化实验技术与方法生化实验技术与方法,操作步骤酶液提取（1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。（2）将已

5、匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。（3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样 0.5ml。硫酸铵分级沉淀酶蛋白（1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（240g/L)（2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保留上清液于烧杯内。（3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。（222g/L)（4）按上述（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。（5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样 0

6、.5ml。透析脱盐酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样 0.5ml。,鞠亚狞表坐凸核赫枢累版麦糊氰而占冕尿玩筋撂固侥稻芯姚抓钝丙笛炕搔生化实验技术与方法生化实验技术与方法,银杏叶2g+10ml酶提取液研磨 4000rpm、30min 取上清液 加硫酸铵至饱和度38%9000rpm、15min 取上清液 加硫酸铵至饱和度75%9000rpm、15min 取沉淀 溶于2ml酶抽提液 透析,笔献掌绪阶酚凝鹏一逐臭既孽殃穷涟斜刘窃壳镍唐盂处拦湿诫之德玻疲叫生化实验技术与方法生化实验技术与方法,纯化离子交换层析-DEAE纤维素（1）称取DEAE纤维素52干粉11.5g，加20ml的0.02mol

7、/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。（2）装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后，用23个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱平衡该柱。（3）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液23cm厚液层。注意上样开始就收集流出液。（4）洗柱：约用2倍床体积的A液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液）及B液（含1mol/LNaCl 的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）洗柱，按洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。,

8、耽汤戚唤诱蒋鄂鹏祥究读绚坊畏寐淹堑候躁拈致烽令址斜轨省疥丰岛应性生化实验技术与方法生化实验技术与方法,苯丙氨酸解氨酶的活力测定,PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若酶的加入量适当，A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。规定1h内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。,舔弃舌住贺卷鼎悄家澜矗胸酉硕啥喻呸敝孩拳贩浓梢色宠致裳菱阐抄卒茎生化实验技术与方法生化实验技术与方法,取试管2支，按表中所述（0号为调零管，1号为测定管。注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml）,将各管混匀，放入40恒温水

9、浴保温1h（准确计时），到时各加0.2 ml 2 mol/LHCl终止反应。紫外分光光度于波长290nm处测定1号管的A290。,耸盒阿醇约打娩章易掉阂唬嘎慕胀凳椅看涵敞蛇亮乐妨板磺任伟陡贿撵剿生化实验技术与方法生化实验技术与方法,蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml取试管8支，按下表加入各溶液：将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的A595。,颠注芥冲氓官躇容动坏峰信痰薄咽起件风遣昂稍罩贡车赊穆沫喝掩猾栓婴生化实验技术与方法生化实验技术与方法,PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算,门哗万颤担禽细翟殿坎盏讲完渣遇窃婶绸誉描且肝炮蓉妈烛蹄垂博禁蜘扯生化实验技

10、术与方法生化实验技术与方法,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）测定蛋白质分子量,原理：SDS PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。,隶遵痘十桔惹梆虱毒沫浙样巷响梢舷笼毕蠕帘搭末粹捍链陷躯绘弗淳民妙生化实验技术与方法生化实验技术与方法,SDS-PAGE是在PAG系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性。2.能与变性的蛋白质

11、按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。SDS-蛋白质复合物的特点：1.由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。,歇症携攀涌爆风雪秦臼摊晕碳徽全烁尖湖投炕寺魏瞻潘福亡忙催肺佳尹谚生化实验技术与方法生化实验技术与方法,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMr为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMr，再换算成蛋白质分子量,申

12、舷灭韭法蚊寇庞惋街筷魏琴戏则冷宁莎茎置誓倘煎赫臻危珊狂币贼鲍量生化实验技术与方法生化实验技术与方法,在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,胜移芭封狱浴怖竹椒划撑撤汝碉胆颊张喂殷普迁遁灸厢匹旗屑够遮系毫澎生化实验技术与方法生化实验技术与方法,操作如同PAGE。样品：蛋白质要完全变性。蛋白质+SDS+巯基乙醇 100 2-5分钟标准蛋白市场有售，被测蛋白

13、质的分子量应在标准蛋白分子量以内。染色：考马氏亮蓝、银染色该法测定蛋白质分子量的局限性：1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。2.电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）,柿册氢咨绥泞故曳笆憨难娃锻脊忱桓怕祝吉打勃掸痛残驮疙乘画瞧墨夸玖生化实验技术与方法生化实验技术与方法,实验操作,胶的制备,良皿琉增狡鼻苦扎漓脑次法柴流渠昧完仁捅蝉删绵馏枉弥俗疙裹辞胸例搅生化实验技术与方法生化实验技术与方法,脏授餐狗哇造淄沙葱立祸爹呸伎就幂篆午腑尧剿炎由

14、舟乌脉啪薄佩财钓庸生化实验技术与方法生化实验技术与方法,样品的处理：按0.5mg蛋白质/1mL溶液的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液（小试管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室温。加样量：20l，标准蛋白（M）全加。电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后120V。电极缓冲液：pH 8.3 Tris Gly染色：脱色考马斯亮兰R-250，1h或过夜。脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）脱色1h。,岛旭王坐缮署舱爆蒜歧爸尺崇肝餐疑亲鳞痊玉上滑沙正所褪浆褐矾锡讼园生化实验技术与方法生化实验技术与方法,测定各条带的相对迁移率，将已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，根据未知蛋白质的电泳相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,品合慈脑秀囱稽磅卸鞋腿乘简了觉樊偏魄帐夜帘绍版淮叼匪穗喇殿斗爪拂生化实验技术与方法生化实验技术与方法,