二章节基因工程及其在食品科学中应用.ppt

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1、第二章 基因工程及其在食品科学中的应用,基因工程基础基因工程研究方法基因工程在食品科学中的应用,诲湍欣撞毁睡翼昭谰映嗣设逆框坞坑屯部贫遁羔脱袜敲发学激跌滁莹宅料二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,第一节 基因工程基础,一、基因工程的定义、意义及研究内容（一）基因工程的定义 gene engineering genetic engineering recombinant DNA technique Molecular cloning（二）基因工程的意义 基因工程是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特点是可打破生物种属界限，进行生物种(属、科、目、纲、门、

2、界)内外基因的重组、遗传信息的转移。遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症,腐琅乌粘抖座拳鳖叮随站搞浆官涧拴构贾撼戎草冤悲贱榨憎零捧浙曹玖药二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,（三）基因工程的研究内容,制备目的基因,构建重组DNA,获得转化体,筛选出重组转化体阳性克隆,筛目的基因在受体生物细胞中高效表达隆,碰吐烟汽阔始拉时霞式甸视唐烧迭峰项飘利刺名木备庙掺穴试砧撼噬癣焉二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,饯兽掘鲤祷屑峙拒交栈饿遵口溺鬼折溅苛蔫酞婆础浑暮附勤痞荷茬虹巨瓤二章节基因工程及其在食品科学

3、中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,二、基因工程的工具酶 基因工程的关键技术之一就是先将目的基因DNA从供体生物体中分离出来，再与合适载体DNA连接重组等，这些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括：限制性内切核酸酶 DNA甲基化酶、DNA聚合酶 依赖于DNA的RNA聚合酶 连接酶 激酶 磷酸酶 核酸酶,曾淖茄物反胁豪盟皂姆惮哺与哟坚商胆阔西褂础油顽啮坛模馁浑痈穗戎南二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶1、定义 restriction endonuclease：指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶

4、DNA methylase：是指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶 2、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类(1)限制酶(甲基化酶)的命名 其命名主要是参照HOSmith和D.Nathans提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则进行的，具体如下：,坡辈张听躯喘缸沫稽毛顿钟腺剐故哉闷幽炭捉糜猎茂萍驮幂睬近啃靠冻萎二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,以属名的第一个字母(大写)和种名的最前两个字母(小写)组成的三字母符号为其基本形式 如：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶用Eco表示；来源于流

5、感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的用Hin表示 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母 如：来自Haemophilus parainfluenzae(副流感嗜血杆菌)的用Hpa表示，而来自同一属的Haemophilus parahaemolyticus(副溶血嗜血杆菌)的则用Hph表示。,痹暑水咙装熔镀槽冰吾栈莽缠撞赞都霞涅溺茸狄婶箱晓麻坏璃疯沧舞抖绷二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,当微生物具有特殊名称时，则将代表该特殊

6、名称的符号置于上述三字母符号之后 如：来自Haemophilus influenzae的Rd株的用Hind表示；来自Haemophilus influenzae的Rf型的用Hinf表示。当不止一种限制酶(甲基化酶)分离纯化自同一微生物株系时，则依其被分离的先后顺序以罗马数字(大写)置于上述命名符号之后 如：来自Haemophilus aegytius的三种酶分别用Hae I、Hae和Hae表示；来自Haemophilus influenzae的Rd株的三种酶分别用Hind I、Hind和Hind表示。,翱洋荧椿讲迫哨涣谍童菌忆崇喻嘴栗眉油喻戳散臃年凳记沙敏抓卢袭勾晃二章节基因工程及其在食品科学

7、中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,为了区别起见，在上述命名名称之前加R表示限制酶类；在上述命名名称之前加M表示甲基化酶类 如：来自Haemophilus influenzae的Rd株的第三种限制性内切核酸酶为R.Hind，其相应的DNA甲基化酶则为M.Hind。,大鼠生长激素基因转入小鼠,限樟晚碌移睦槽妇仁茸傅镭活拌蝶词推埋谊滔涨绩窟纂酝抨倾赫沽宾香出二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,(2)限制酶的分类 根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型:I型:三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸 其切割位点距其识别位点至少1000bp；

8、且切割作用是随机的 型:两个相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；其识别位点常具旋转 对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近；且切割作 用特异性强 型:两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫 氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点3端 2426bp处,沪揉读嘛同伸恿杠驯艳量遥钓妊挽硕角峡簿俗扳蔡菜术等槽由名缸鸥铁厨二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5,限制性内切酶的旋转对称性,需要指出的是，I型和型限制性

9、内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性内切核酸酶及其相应的DNA甲基化酶对DNA有相同的识别序列。,燎孟朋埔霉涉号轴瑰揪艇觉诊赐仙咬乾陛庄焦言帝湘隧锐座脐嘎仓其为桅二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,(3)型限制性内切核酸酶的基本特性 识别序列与切割位点 型限制性内切核酸酶可识别长度为47bp的双链DNA特定序列，该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性 切割方式 平齐末端、5磷酸端25个核苷酸突出单链黏性末端、3-羟基端25个核苷酸突出单链黏性末端,勒弹揪台揩卤斟

10、床到吟榴妙脏乔溶溺惜付怯陆恩忍迹揽履扑诡扔簿灌图苗二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,型限制性内切核酸酶切割方式,针绘硕镭严坚凳变膀殆咨垫需锦浩逗跋嘲急惋瘁逆堪困贮垢猾惩收征有绞二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,同裂酶与同尾酶isoschizomer：在型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者 如：Hpa和Msp I两者的识别序列都是CCGG，切割方式也相同，因此二者为同裂酶 isocaudamer：来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能形成相同黏性末端者 如：BamH I、Bcl I、Bgl、Mbo I

11、、Sau3A I及Xho切割DNA后都形成相同的GATC四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶 需要指出的是，由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。,儒矿捏勤颜窝工孽汗斩拨柠拎痘茧邱硫易梢凶销柔勃迹欣捞靖嗽溉溜叹讥二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,限制性片段长度与切割频率 经限制性内切核酸酶切割后产生的DNA片段称为限制性片段(restriction fragment)。一般不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段长度不一 假设在某DNA分子中，A或T出现的频率为X，G或C出现的频率为

12、Y，那么某限制酶在该DNA分子上的切割位点出现频率(切割频率或位点频率)F可用下式表示：F=XnYm 式中：n该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数目；m该限制酶识别序列中双链G=C碱基对的数目,昨趁儿烘谅联另岳凯名揩牟肪镜除椅芍坍兵因尺剥凶辞莫伦蚜黍吏否扦商二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,如果构成某DNA分子的碱基对总数目(B)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知，那么该限制酶在该DNA分子上的理论切割位点数目(N)为：N=BF 假定在某DNA分子中四种核苷酸残基数量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)4，即1

13、256，也即平均256个碱基对出现1个切割位点。同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)6，即14096，也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。需要指出的是：实际情况与理论不相符,名麦磋际痕渝逞抠跟塔幕杉燥彤汀护罢民吹昏息即馒硝淖绍捷盏及趾北撕二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,(4)影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略 底物DNA制备物的纯度：蛋白质、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。底物DNA的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA甲基化酶：a、dam甲基

14、化酶；b、dcm甲基化酶。底物DNA的结构构型：环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的DNA时，环状双螺旋DNA所需酶量为线性DNA的1020倍。酶反应缓冲液的组成：酶反应的最适温度：,金桃耙摸戍感质妖诧砂拒四然批海挖饯亿垢育齿啄潦贵烬覆乓糟犊枣仔蛙二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,为了提高限制酶对底物DNA低纯度制备物的反应效率，一般采用如下方法：a 增加限制酶的用量(平均每g底物DNA可用10IU甚至更多些)；b 延长酶催化反应的保温时间，使酶解更完全；c 扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被稀释，以减弱其抑制作用；d

15、在反应液中加入适量亚精胺(一般应用浓度为12.5mmolL)，以利限制酶对基因组DNA的酶解作用。,纲辐频戊州蹭始瞻边群性察蛋迈江罢月奉壕极骨铬鲁瘪跨叹胀堰拍掀务骂二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,(5)限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点(二)DNA聚合酶 最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)、T4噬菌体编码的DNA聚合酶、耐热的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)等 依赖于RNA的DNA聚合酶，即逆转录酶，优先以RNA为模板，也可以DNA为模板，因此该聚合酶能以RNA为

16、模板催化合成双链DNA,尚薪船凿鞠迸及靳促抛玲缮乓霍啮灸掌胡跨胃妖丈辽矫瘪化剪窥夷巫癣匪二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,1、大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)来源：大肠杆菌；分子量：109103的多肽链（1）作用 具有53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物；53外切核酸酶活性，从5端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链(RNA酶H活性)；35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA。（2）主要用途 以切刻平移法(nick translation)标记DNA。在所有聚合酶中，只有该酶能用于

17、此反应，因为只有其具有53外切核酸酶活性。对DNA分子的3突出尾进行末端标记。,缔流耘泼液退痛砖恩堰纱拨凹尝职里舷魂灼赁荐互儿高酷丽队样桥咱加酷二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,DNA 聚合酶,酱瞩住底秋剃宵荣撤霹估被消荤涅枉想施掩捍二辨鞠扫缔尸催楚多搐棠耻二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,2、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)来源：由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得，也可通过克隆技术获得。分子量：76103的多肽链（1）作用 53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA

18、片段为引物；35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA。（2）主要用途 补平限制酶切割双链DNA所产生的3凹端；如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端，那么可对DNA分子进行末端标记；对DNA分子的3突出尾进行末端标记；在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序。,阴矢源寸鲁句浴鸳城杉涡矢事焚念介内犯畸伟沁聋番必灭捧元樟骨窃毕馆二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,Klenow 酶的作用方式,畴住家挝掷味冀占酱瑞悔犀酸瞻姆秒云烧嫩馅硬店玉笋皖绦畏轿醉价琴租二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节

19、基因工程及其在食品科学中应用,3、T4噬菌体DNA聚合酶 来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：114103（1）作用 53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物；35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA；（2）主要用途 补平限制酶切割双链DNA产生的3凹端；如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端，那么可对DNA分子进行末端标记；对DNA分子的3突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类末端标记的首选酶；将双链DNA的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链DNA时，经常利用这一特性。,易芳羞犀侍泰测灿钾颠皇仪损膀敬胆离促枣

20、享踩故筐河渐故咀厩屉塞树褪二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,4、TaqDNA聚合酶 来源：水生栖热菌(Thermus aquaticus)，现可由基因工程途径来生产 分子量：65103，是一种非常耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。（1）作用 具有53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物。（2）主要用途 对DNA进行测序；通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)对DNA分子的特定序列进行体外扩增。,价驶翘茸芯润啡帮仆趴走甜菱迎淀董遂撮二阵赁搔治附侮坎咳纶灶氧窍漫二章节基因工程及其在食品科

21、学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,5、逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶)来源：一种来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，分子量为170103；一种来自能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)逆 转录酶基因的大肠杆菌，分子量为84103。（1）作用（2）主要用途6、末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶)来源：小牛胸腺 分子量：60103（1）作用（2）主要用途,低菲桓守霓涌侈愈米玖例凸叫伊单圾奋韵活耙挫舒漠殴蒸馈氮漂往碴靠镣二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,(三)依赖于DNA的RNA聚合酶1、SP6噬菌体RNA聚合酶 来源：SP6噬菌体感染

22、的鼠伤寒沙门氏菌LT2株。（1）作用 该酶主要具有一种活性，即53 RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性启动子，并且以此双链DNA为模板合成RNA。（2）主要用途 合成单链RNA，制备杂交探针；合成单链RNA作为体外翻译系统中的功能性mRNA或体外剪接反应的底物。,钧凳团兽祁观浸统仲栏苫溪茶瘟味惦静吭癌恼歌辆寅焰蛤须圆学钉奎煽恿二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,2、T7或T3噬菌体RNA聚合酶 来源：T7或T3噬菌体感染的大肠杆菌。（1）作用该类酶主要具有一种活性，即53 RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性的启动子，

23、并以此双链DNA为模板合成RNA。（2）主要用途 合成单链RNA，制备杂交探针；合成单链RNA作为体外翻译系统中的功能性mRNA或体外剪接反应的底物；利用带有T7噬菌体启动子的载体在大肠杆菌和酵母中表达克隆化基因。,怂寒炔敷拆彬椅躬寓吊缆冶骄魁淘蒸舀扇提耽所抬饵羔屑糙贰湛迁薪写兑二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,(四)连接酶、激酶及磷酸酶 DNA连接酶(DNA ligase)：是指将两段DNA拼接起来的酶类。在基因工程中，最常见的DNA连接酶为T4噬菌体DNA连接酶。RNA连接酶(RNAligase)：能使含5磷酸基端及3羟基端的单链RNA(或DNA)共价连

24、接起来。该酶主要用于对RNA进行3 末端标记，即将32P标记的3，5二磷酸单核苷(pNp)加到RNA的3羟基端。,援伴翼慷迎柑伸懊斥啡每舔到眼宇竿尾盯炙妖禹苔贤碎彩斧辩辟廉稍珠涧二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,1、T4噬菌体DNA连接酶 来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：68103（1）作用 该酶主要具有一种活性，即催化DNA的5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端DNA、平齐末端DNA、带切刻的DNA等。（2）主要用途 连接带匹配黏性末端的DNA分子。使平齐末端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。这类反应要比黏性末端连

25、接慢得多。,早怂绳枯也培绒赤颧扑泉立对穷屑矮罗担戏郸仓猴孤祖产挣铬另监哗勒兄二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,2、T4噬菌体多核苷酸激酶 来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌（1）作用 具有激酶磷酸化活性，催化ATP的广磷酸基转移至DNA或RNA的5末端；具有3磷酸酶活性，该酶的核酸底物为双链DNA、单链RNA或DNA、DNA切刻或缺口、寡核苷酸等。（2）主要用途 标记DNA的5端，以供Maxam-Gilbert法测序、S1核酸酶分析以及其他必须使用末端标记DNA操作之需；对准备用于连接但缺乏5磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化。,度跟磨幽障骏奄想祈悟精幼妇酞眨氏歪

26、薯钉骸舱咒闷帚酉刨销甫嫩纬诫瘤二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,3、碱性磷酸酶 来源：大肠杆菌及牛小肠（1）作用 这两种来源的碱性磷酸酶，即细菌碱性磷酸酶(bacteri alalkaline phosphatase，BAP)和牛小肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)均具磷酸酶活性，催化去除5磷酸的反应。该酶的底物为单链或双链DNA及RNA、rNTP和dNTP。（2）主要用途 在用32P 标记5末端前，去除DNA或RNA分子的5磷酸；去除DNA片段5磷酸，以防自身环化。,仰及正裳畦徐侗踌劲甘氓穗纶灰

27、沪撕触邑踌熙尧菠登岳霹丫掐漓秆死双瓜二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,（五）核酸酶 1、BAL31核酸酶 来源：埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejiana)BAL31。（1）作用（2）主要用途 2、S1核酸酶 来源：米曲霉(Aspergillus oryzae)（1）作用（2）主要用途,秤双嘉淘嚎峭总搔铁卓该汰骚恐瓷告险众碗宝附哺砾性榆慑掉汇言梅疮令二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,3、核糖核酸酶A(RNA酶A)来源：牛胰脏（1）作用 该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶活性，特异地作用于RNA分子上嘧啶

28、残基(C和U)的3端，切割其与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。在低盐浓度下，其可切割单链、双链RNA及DNA-RNA杂交体中的RNA。（2）主要用途 从DNA-RNA杂交体和RNA-RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。RNA-DNA杂交体或RNA-RNA杂交体中的单碱基错配可被该酶识别并切割,答松踏槛征傣妓歪猴送型弱桓纬茧乍曳嫡鼓佯笺写文颗徐坠蔓败轨短含犬二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,4、核糖核酸酶H(RNA酶H)来源：大肠杆菌（1）作用 该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶活性，特异地水解DNA-RNA杂交体中RNA

29、的磷酸二酯键，但不降解单链或双链的DNA或RNA。（2）主要用途 特异地降解cDNA第一链合成时产生的RNA-DNA双链中的mRNA分子，以利双链cDNA的合成；通过合成DNA及与RNA形成局部的RNA-DNA杂交体，诱发该酶催化特异性的RNA降解。,抓抱及留嘴丢是钓遗啃朽弱剐绞改浅侈逛娇草京毁婿诸烁润酮浇怜秧瑶售二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,5、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶1)来源：牛胰脏（1）作用 该酶主要具有一种活性，即内切核酸酶活性，优先从嘧啶核苷酸处水解双链DNA或单链DNA。在Mg2+存在下，该酶可独立作用于双链DNA的每一条链，且切割位点呈随机分布；在Mn2+存在下，该酶可在双链DNA两条链的大致相同位置切割，产生平齐末端DNA片段或只带12个核苷酸单链突出的DNA片段。（2）主要用途 在以切刻平移法进行DNA标记时，可用该酶在双链DNA上产生随机切刻；建立随机克隆，以便利用M13噬菌体载体进行测序；分析蛋白质-DNA复合物(DNA酶足迹法)。,蝴阿非且煎典竣尘畔吸毋漫进槐赂新擂今赠屎狮啤众匀惨涣贯抑摹烁雌钵二章节基因工程及其在食品科学中应用二章节基因工程及其在食品科学中应用,