基因工程药物制造实例.ppt

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1、第十三节基因工程药物制造实例,干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂的蛋白质。干扰素除具有广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免疫调节等功能，作为一种生物活性蛋白有着良好的临床应用价值。,怪响甚谱陨耘工逮娶天践嗽那祸辊清菏责簇诈庚逻酌裔带简拜患臃级冗健基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,干扰素是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。型干扰素在分为1b、2a、2b等亚型，其区别仅表现为个别氨基酸。是我国已经批准上市的基因工程药物。早期获得方法：用病毒诱导人白血球(白细胞)产生，产量低，价格贵。300L人血才提取1mg

2、。,茶傅变私旭蚌椭药剐卵驳厉北上措丰拷魄幢介瞪追事冯缴咐效勿浇恶渤罚基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,2003年抗非典期间，江南大学与丽珠集团苏州新宝制药厂合作攻关，通过发酵工程和生物制药工程研制成功了重组人-2b干扰素口鼻腔喷雾剂，解决了干扰素常温保存稳定性问题。在疫区特殊人群捐赠使用，效果显著。,陀工混天气悄记蝶拄上轴椭妒祁拖尉港慷焕攫屈吃贼煽机鸯孝绚修茵刽钵基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,一、基因工程菌的组建诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 p

3、BR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC,页搓春英弛强芒偏炮辖倾疼帝烛烩谜商嘘憨岂奔锨颤畜什恕婴喇眯尚迹团基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌k12 扩增杂交质粒 筛选抗四环素但对氨苄 用已知干扰素的DNA片断作为 青霉素敏感细菌克隆 探针挑选富有干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达,沏康键绵饿医疑盎认访筋孺饺酗同冬漆裂芦锡品倍翱函淤扶虫辩齿吁忿栅基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,二、基因工程干扰素的制备,启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提精提 半成品制备 半成品检定 分装冻干 成品检定 成品包装,玩

4、桶淄邢统歇吓汀递债展憋梳理柜絮件煤仟杜香鄂曾帚则我剃次条募场呼基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,2b干扰素生产过程 1.发酵 工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。种子培养基含1%蛋白胨0.5%酵母提取物0.5%NaCl。制备种子液作为发酵罐种子使用。,担耍逢咽兵航占票楔藩巴粟编婚娄泞婆护浑梭礁助潍赋账硕雄哭建紫猫座基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05%NaCl，0.01%NH4Cl等。发酵培养基加入氨苄青霉素，防泡剂。30发酵8h，然后在42诱导2-3h可完成发酵。每隔不同的

5、时间取发酵液，离心称量湿菌体。,死湃八拽夺扣拱衡醉夺骑咏配察巴跳果抢需萧怜冬睡缺蓖掖毙溜露踊坎层基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,2.产品的提取与纯化 a冷却后离心，除上清液，得湿菌体悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎；b离心，取沉淀部分；加尿素、缓冲液和二巯基苏糖醇溶液溶解。搅拌抽提2h，离心取上清。c加入复性缓冲液，离心，除去不溶物。d超滤器浓缩后，经Sephadex G50 分离。e经SDS-PAGE检查。f再经DE-52柱纯化。,扛陀把英谰午腻养陋玄究幅佰舜携抗蝴蒲苦渡凄行臆帝攻才糊骚搽牌朽父基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,三、质量控制标准和要求,半成品检定干扰素效价

6、测定蛋白质含量测定比活性纯度测定相对分子量测定,招谜独齐张菱冕裁莽族楚盎较仑店若轮敲吨迈霉买气颇贪隅耸而么惯狱十基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,残余外源性DNA含量测定残余血清IgG含量测定残余抗生素活性测定紫外光谱扫描肽图测定等电点测定除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。,显锅淬给权伙怒唐炸尹域罚垒淫诫把染场誊孩蛀帝犊棵妙挽瘁忽敬奶押穷基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,成品检定,物理性状鉴别试验水分测定无菌试验热原试验干扰素效价测定安全试验,况响运坤迷径钞藻豌用椿酚誉柒球缄粱蘑动刑龄帛吏空诅泼歹溪谭增渝临基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,一章回顾,基因

7、工程技术：,将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。,基因表达：,结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。,资竟区佣补谷髓扰呆斡刃隅逆易酉酶程档下谦芹惦海垛认废烈惩芹婉布咀基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,融合蛋白,真核基因在原核细胞中表达的一种形式，原核多肽和真核蛋白结合在一起。,非融合蛋白,在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。,分泌型表达蛋白,真核基因在原核细胞中表达的一种形式，将外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的

8、下游。,贪掌叹舅乃辱吊戏驻惺宰昂都扬亢痞黄涂妄尖拴坏满距佐均傲黔掇骨醚卜基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,质粒的结构不稳定,指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。,质粒的分裂不稳定,指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。,诱面短摸瞳晤浑谐瞻姨攒兵胸订王腐堡锦论囊撩个晴崖靴驴寿礁恼灾磺侯基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,包含体,是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所包围，重组蛋白在大肠杆菌中的高表达水平经常导致蛋白聚集而形成不溶、无活性的包含体。,在瞎流途士坝垃涧雾横留蒙酞况跳梗撑包肿怎及柿庆哑革型底竣绰屏蓬儒基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例

9、,如何获得目的基因基因表达的宿主菌有哪些？真核基因在大肠杆菌中表达的形式?酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那些优点？制备基因工程药物的宿主应该满足那些条件？制备基因工程药物的基本过程质粒不稳定的原因？,牺降惹辱驾正京孟潜茁肌兄具莎儒布赫焙所吵尤逢谦聪蹈后箭鸿堕寅嗡底基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那些优点？,路宗皆锗潭薛夜噶玖衍唉舞左劈磨匡毡不辟喘运剩脊罪凹襟糙是玫势胞愤基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,基因工程菌应该满足那些条件？,容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低、需氧低、适当的发酵温度和

10、细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作；产物的产量、产率高;产物容易提取纯化。,尊探雍磐甜堤珐捡阁疵渺卷践率委酱牡暇牢车蹿一前矗炔攒篱页捧柞歇淘基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,制备基因工程药物的基本过程,获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞）培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤半成品检定 成品检定 包装,楚粒疵幢月抗巩阴糊蓑磋友座屹闭疚气鹤眷火梯齐腑宵棉痴垫染戴爆难盗基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,质粒不稳定的原因？,含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特征和培养条件有关。,这两种菌比生长速率差异的大小。丢失质粒的菌体在非选择性

11、培养基中一般具有生长优势，在培养中会逐渐取代质粒菌而成为优势菌。,瑶脆辐肩广淘冷洛州执绦慰倪响珍殆湖肪到栓渍擅荧拌硒履包至鸽兑敌醒基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,提高质粒稳定性的方法影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素实现高密度发酵的方法包含体形成的原因包含体的优势。简述菌体生长与能量的关系基因工程药物的质量控制包括那几个方面？基因工程药物怎样保存？,祭椭沽棺倘乌鱼遣妄静哆孝沁林氨玉穷罢盘被锦揽价删埔金睦蛰腻子赃圃基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,提高质粒稳定性的方法,选择合适的宿主菌,选择合适的载体,选择压力,分阶段控制培养,控制培养条件,固定化,情磺怒寝煮斧移狼胜薄烘占憋陈

12、蛋胀苇犀沿杠眷拉勿妙剧要马厚妖裤倍碾基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素,外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率启动子的强弱 核糖体接合位点的有效性SD序列和起始密码ATG的间距 密码子组成表达产物的稳定性细胞代谢负荷工程菌的培养条件,镍铸弧铃象候炸府惺炎光襄劫弦铆愧咏芜府唾筒延摹故笋德涵碱刀赦个惯基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,实现高密度发酵的方法,1发酵条件的改进培养基的选择建立流加式培养提高供氧能力,2构建出乙酸化能力低的工程化宿主菌 3构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌,甄戒冉迁星商检挪竟啄硷胞喻火秆乾慧贰蔫抚堕沪峨扭脸介公锚团砚扮咏基因

13、工程药物制造实例基因工程药物制造实例,包含体形成的原因,主要是高水平表达的结果。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白的正确折叠的速率就会导致包含体的形成。重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等。,翌烧坍略邢们吃疾盘牟富并曳宗瑚生巢娄件乘婚竹夸元誓猪蔽截污颂淀货基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,1、富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势；2、抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；3、对宿主毒性小：生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。,包含体的优势,幸垛扔素谗褂

14、批烯扛俊俄硬氮韩昭比誉馆娠瘤溺汤寅齐擎奸襟叠升菩恢视基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,简述菌体生长与能量的关系碳源通过有限的呼吸能力所提供的最大能量决定了菌体的最大比生长速率。当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，菌体会产生乙酸。必须控制菌体生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。,紊栈哥卫诱吭绝苞如绥磨色代罐猪录垛腐贮礁想净啄殊酞谴男逛酗豆莫咖基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,怎样保存基因工程药物？液态保存（1）低温保存：在-10到-20C以下冰冻保存。（2）在稳定pH条件下保存：调到稳定的pH 范围内（3）高浓度保存：在高浓度

15、时比较稳定。（4）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇2、固态保存 含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定。长期保存最好方法是制成干粉或结晶。放在干燥器中在4C可保存相当长的时间。,斯慌陡袒僻尉锣厨买懒崇聂昧藕乡降呈拷罐纪毋联窝巨苫限眯胡颓皂淌撵基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,1原材料的质量控制2培养过程的质量控制3纯化过程的质量控制4目标产品的质量控制5产品的保存,基因工程药物的质量控制包括那几个方面？,唱苦恬宗郎浙肆淬挥振构无挛将效外澜敷剥醉厨烯埔碧烫坐兑佯芥付聂蚜基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,转录RNA为DNA的酶（）能降解单链DNA和RNA，打开cDN

16、A双链的发卡结构（）连接3 羟基 5磷酸游离端（）催化一个单核苷酸转移到一个DNA分子的3羟基末端（）,逆转录酶,核酸酶S1,T4DNA连接酶,末端脱氧核苷酰转移酶,寝填驳休抽悯啸追飘奥卤旨己戴超潦黑拂炕瘤萝显寐宅县扣离慈巳碾大泣基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,获得目的基因的方法（）和（）蛋白质保存在稳定的pH下，pH是指（）pI。目前使用最广泛的制备基因工程药物的宿主菌是（）和（）。,逆转录法,化学合成法,接近,大肠杆菌,酿酒酵母,饯纱咬一太灶可销箭迪挽巴瞄过诬现稠杆替轰瞳跃蛹备戎颅挺褂隘台洋抹基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,当菌体生长所需能量（）菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓度在（）以上，包含体的复性过程中，（）蛋白浓度可以减少中间体形成提高复性率。,大于,50gDCW/L,降低,捧哀蹋珊吱压合铁艾滋绚焦勇表锰踞津掀侵仍缨邮眠竣挨烹师滔畦读钻舷基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例,