色谱条件的选择.ppt

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1、色谱条件的选择讲稿山东大学 王吉顺2005.8,攫隘眨呈果札衡感鹃强衔睛摘秘夏蜗苛淑租焚衔徽钳任烦还慷若名革判神色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱条件包括以下内容：1.仪 器：生产商，型号2.色谱柱：柱商品名称，填料商品名称，填料类型，色谱 柱长度（cm）和内径（mm），填料粒经（um）3.流动相：流动相组成和比例，流速（ml/min）4.检测器：型号及参数（如波长nm）5.进样量：体积（ul）6.柱 温：（）其中我们更为关心的是：色谱柱和流动相（本章节主要讨论的问题）,非洒巴能屈沤缝玛宁抠承串完海牧不焉颈漆落宿嗜探肃蒙接搐吴惶犯竿锤色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱的选择,大多数化合物是可

2、以使用C18柱分离C18优点：柱便宜，流动相便宜，使用时间长，易于通过改变流动相得到最佳分离，药品本身具有纯度高的特点，容易分离，辅料和分解产物是分离的难点。比中药成分的分离，体液中药物成分的分离，微量成分的分离，杂质成分的分离，食品中药物残留的分离简单的多。,苑麻良鬼培陨砚辽池农耙峨蔬萤牡拇魄奶痒勾沸笆道奄扮钝铡姑侧搓拉伎色谱条件的选择色谱条件的选择,选择色谱条件的方法,1查文献，学习别人的方法2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件3自己积累药物分析的色谱条件，从中寻找规律，尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。不建议在自己对被分离物质的性质

3、不了解的情况下，自己摸索色谱条件,躲由伏钳揪有佩士泻茬掺河懂堪兴夕粪喝虑昆丁很村蚜半之舱夯晾氦巧仅色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱的分类,1 根据担体材料分类（1）硅胶型：SiO2；C18；C1三甲基；C2；C4；C8；CN；NH2；苯基（2）聚合物型：聚苯乙烯类（离子交换；凝胶色谱柱）；聚丙烯酸酯（离子交换）；聚乙烯醇：C18；离子交换（3）钛柱：比硅胶型的稳定性提高（4）其它类型,娘拣赂仪癣圈绍潦互盯眠踪俐脂杜落柿春俐予赵互执薯皂陀嚎礼厌撂哄禾色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱的分类,2.根据分离方式分类(1)正相：SiO2；CN；NH2；苯基(2)反相：C18；C1三甲基；C2；C

4、4；C8；CN；NH2；苯基(3)离子交换：弱碱阴离子交换；弱酸阳离子交换 强碱阴离子交换；强酸阳离子交换(4)凝胶过滤：水溶性凝胶过滤；油溶性凝胶过滤(5)其它类型：手性柱等,企考寞苯镀躇均蚀蒋咐慎量愿铃迫贸活猫忻肩仙框刮闽岸但啮雄璃竟图湾色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱的分类,3.根据色谱柱尺寸分类（1）10cm50cm内径为制备柱（2）4cm8cm内径为标准柱（3）3cm一下内径为小孔柱或微孔柱和毛细管柱（4）柱长一般为15cm、25cm、30cm；50cm一般用于制备柱或特殊柱型，5cm一下为快速柱(包括预柱和保护柱),贼稍霖奎彝频抛呈窝汤幻伺膀涉驻拔宿致样氯询氦举绸左玫乔猎饭胖辙

5、组色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱选择方法,1.氨基酸(1)结构特殊，一般使用离子交换柱分离，阳离子交换柱是使用最广泛,是最成熟的方法。分离氨基酸的阳离子柱分为锂型柱和钠型柱，锂型柱可以分离谷氨酰胺和谷氨酸。(2)反相柱也可以分离氨基酸，但不能分离所有氨基酸。柱前衍生化法分离水解氨基酸也非常有效，且方法简便，所用的仪器简单。,搂朋孺阮奔卯崔鼻想围澎院蛊蹲栗貌妒羌驳狗洁痘曰猎宫席遇恨豆识牵蜡色谱条件的选择色谱条件的选择,氨基酸分析,分析条件：色谱柱：Shim-pak ISC-07/S1504Li（15cm 4.0mm）（Li型磺酸基，氨基酸分析专用柱）流动相：柠檬酸缓冲溶液，梯度洗脱流速：0

6、.3ml/min柱温：55检测器：荧光（Ex.238nm,Em450nm）方法：OPA柱后衍生化法,芯诌叉街蒲万绍均仲郊蠢还辐淀啤式孩沦缄孟蔚悄镀耙鱼糊双蓖颁铆扔霸色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱选择方法,肽和蛋白质 凝胶过滤：根据分子量的大小差别进行分离离子交换：根据分子所带的电荷的差别进行分离反相和疏水色谱：根据分子的疏水性质的差别进行分离亲和色谱：根据复合的相互作用的差别进行分离,沂熔惰杀瘩聂枉抽再责袜犬筑琴涣臃袱逆吓井畅翌钳酮摄涪券斜刑时罚娱色谱条件的选择色谱条件的选择,蛋白质,分析条件：色谱柱：Shim-pak Diol300（50cm 7.9mm）（二醇基水溶性凝胶柱，蛋白质分

7、析专用柱）流动相：10mM磷酸缓冲液（pH7）和0.1MNaCl流速：1.0ml/min柱温：室温检测器：紫外（280nm）色谱峰：1.谷氨酸脱氢酶 2.乳酸脱氢酶 3.烯醇酶 4.腺苷酸激酶 5.细胞色素C,只殊懒仔归无徐彭和重刁圈估钥统枝俯揖茫袒锑橡刊劲责凿布嫂授娄赁肖色谱条件的选择色谱条件的选择,蛋白质,分析条件：色谱柱：Shim-pak Diol300（50cm 7.9mm）（消除残留硅醇基C2柱，300A多孔硅胶）流动相：硫酸铵/磷酸缓冲液（pH7）梯度洗脱流速：0.5ml/min柱温：室温检测器：紫外（220nm）色谱峰：1.细胞色素C 2.肌红蛋白 3.核糖核酸酶A 4.铁传递蛋

8、白 5.糜蛋白酶原A,秀铃辗蕉梧姨抽施遵荔环昨妈沈戚咬溢贬疼侧尼张涟磅漳骋锅巫桃槐撬尸色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱选择方法,核酸 核酸在生命科学领域中占有重要位置，在今后的新药研发领域中同样占有重要位置。核酸可以分为一下三类：腺嘌呤（核酸碱基）腺苷（核苷；核酸碱基糖）腺苷酸（核苷酸；核苷磷酸）腺嘌呤（核酸碱基）和腺苷（核苷；核酸碱基糖）用阳离子交换柱或反相柱进行分离；腺苷酸（核苷酸；核苷磷酸）用阴离子交换柱分离，选择合适的流动相也可以用反相柱进行洗脱；,须橇妄棵焰矩回眉捂圆评轩咨植锦肠鳖擒寝尔奏诵漂画饼鲤磐莆综郊俺傍色谱条件的选择色谱条件的选择,核酸,分析条件：色谱柱：Shim-pak

9、 WAX1（5cm 4.0mm）（叔氨基阴离子交换柱，用于分析核苷酸）流动相：20mM磷酸缓冲液（pH7）480mM磷酸缓冲液（pH6.8）梯度洗脱流速：1.0ml/min柱温：45检测器：紫外（260nm）色谱峰：1.尿苷酸 2.胞苷酸 3.腺苷酸 4.鸟苷酸 5.尿苷二磷酸 6.胞苷二磷酸 7.腺苷二磷酸 8.尿苷三磷酸 9.鸟苷二磷酸 10.胞苷三磷酸 11.腺苷三磷酸 12.鸟苷三磷酸,式铺膀太躯佛删撅讹堵梅耪憨树俭侦髓夜琼窗唤鹤汇堰恍床边寥微各鸽香色谱条件的选择色谱条件的选择,核酸,分析条件：色谱柱：Shim-pak SBCC8（15cm 2.5mm）（小孔径硅胶键合C8）流动相：2

10、0mM磷酸二氢钾缓冲液/甲醇（93/7）流速：0.5ml/min柱温：室温检测器：紫外（260nm）色谱峰：1.胞苷 2.尿苷 3.鸟苷 4.胸苷 5.腺苷,芭扼芦沽听巢助赫糊伸舞韦际米瘸治恼契汽副宏娄枪令洼识二指涩脾冗鸵色谱条件的选择色谱条件的选择,核酸,分析条件：色谱柱：ODS柱（15cm 6.0mm）（经甲烷基化处理的ODS柱）流动相：100mM磷酸缓冲液和 200mM高氯酸钠溶液 梯度洗脱流速：1.5ml/min柱温：50检测器：紫外（260nm）色谱峰：1.未知峰 2.胞嘧啶 3.尿嘧啶 4.鸟嘌呤 5.腺嘌呤 6.胞苷 7.尿苷 8.胸腺激素 9.腺苷 10.鸟苷 11.胸苷,必饲

11、磕凹咸劈烩娄总腰佩窖染荷莱瀑柄饼扦撩赡玲慢著氏苞需缀喊楔醋幼色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱选择方法,糖的分离 糖的种类很多，可分为单糖（木糖，阿拉伯糖；葡萄糖，果糖，半乳糖）、二糖（蔗糖，麦芽糖）、低聚糖和多糖。单糖和二糖可以使用氨基柱分离（分离异构体效果不很好），还可以使用阴离子交换柱分离，缺点是分离时间较长。低聚糖也可以使用氨基柱分离（分离异构体效果不很好），还可以使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离（色谱柱价格较贵，色谱柱不易保存）。多糖使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离。另外还用部分公司生产糖分析专用色谱柱。,赠岳侍满雇蒋惠糙嚼析囤渭宙倘孤骇抿弦曹捍哀塘溜摆闯烷悬澜盾亏庭腆色谱条件的选

12、择色谱条件的选择,糖的分离,分析条件：色谱柱：NH2柱（15cm 6.0mm）（硅胶键合 NH2柱）流动相：乙腈/水（7/3）流速：1.0ml/min柱温：室温检测器：示差折光色谱峰：1.丙三醇 2.木糖 3.果糖 4.葡萄糖 5.蔗糖 6.麦芽糖 7.乳糖,构嗜乙沏苍营由耀瞳激任寡峦旧沽曼撅窗纷妥桑撕辰厘虾奋歪烘爱峙冬洛色谱条件的选择色谱条件的选择,糖的分离,分析条件：色谱柱：磺化聚苯乙烯Ca型柱（30cm 7.9mm）（分离机理为凝胶渗透配位交换）流动相：乙腈/水（7/3）流速：1.0ml/min柱温：室温检测器：示差折光色谱峰：1.丙三醇 2.木糖 3.果糖 4.葡萄糖 5.蔗糖 6.麦

13、芽糖 7.乳糖,橱桅坚寨炬孔宵廉槽庶讹惯颇叮嚷姥汽钒屏扩剑弧秽证添荚挛歉栓螟碰拧色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱选择方法,维生素的分离维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素水溶性维生素：维生素B，维生素C，维生素H，维生素P，泛酸等脂溶性维生素：维生素A，维生素D，维生素E，维生素K分离方式：和脂溶性维生素均可使用反相洗脱法分离。一些脂溶性维生素可以使用分配色谱法分离,襟邦虾卿刚涩贫眶阔检彬暴盔峦蚁粕煤饲虱故官仅阉颂藤娜清痔养榴汐毅色谱条件的选择色谱条件的选择,维生素C的分离,分析条件：色谱柱：NH2柱（15cm 6.0mm）（硅胶键合 NH2柱，分配色谱）流动相：乙腈/10mM磷酸缓冲液（

14、pH2.6）（3/1）流速：1.5ml/min柱温：40检测器：紫外（245nm）色谱峰：1.异抗坏血酸 2.抗坏血酸,暗苫劈富殷巧沫郭埂喂汁谚即奇膛色蛙咱星藻糠配队这讼汝节万框卓牢俏色谱条件的选择色谱条件的选择,维生素E的分离,分析条件：色谱柱：SiO2柱（5cm 4.6mm）（硅胶键合 NH2柱，分配色谱）流动相：正己烷/二恶烷/乙醇（98/2/0.2）流速：2.5ml/min柱温：室温检测器：紫外（295nm）色谱峰：,柑唆观搭偿渔乾乳后泊悟苇婴国磷锦师免薛楼侩思威还旱惨烂搪苏撞堪垦色谱条件的选择色谱条件的选择,维生素E的分离,分析条件：色谱柱：NH2柱（15cm 6.0mm）（硅胶键合

15、 NH2柱，分配色谱）流动相：正己烷/异丙醇（25/1）流速：1.5ml/min柱温：40检测器：紫外（297nm）色谱峰：,听骋肾猿愧腰锻栗锡说碾眉江盎郴蚀啦歧早闪惑登沛返订疗卤镑年废暂船色谱条件的选择色谱条件的选择,维生素B族的分离,分析条件：色谱柱：ODS柱（15cm 6.0mm）（硅胶键合 NH2柱，分配色谱）流动相：【100mM硫酸钠（pH2.1）和1.2mM辛烷磺酸钠】/乙腈（9/1）流速：1.2ml/min柱温：40检测器：紫外（210nm）色谱峰：1.烟酸 2.烟酰胺 3.泛酸 4.磷酸核黄素 5.吡哆素 6.咖啡因 7.硫胺素 8.核黄素,桔讫赞住玖哲失钨贞逮押投份巩骗赁巍馋

16、洞夹瓷杯鼓荷弊片沫酣恿泄里恋色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱选择方法,阴阳离子分离 阴离子可以使用离子交换柱分离，也可以使用C18分离（离子对色谱法）。,雍舆梆伶纶尤官诅宽逮蔷帝妄鳖喀春组果呢啦淀术柜一劲邑褪勺倒眨汹饺色谱条件的选择色谱条件的选择,离子交换法分离二价阳离子,分析条件：色谱柱：磺化聚苯乙烯磺酸基离子交换柱（15cm 5.0mm）（离子交换色谱）流动相：0.3M乳酸水溶液流速：1.0ml/min柱温：40检测器：电导色谱峰：,内燎劲混盔诣识倔垫履费旁忿迅势疽枚寇朗岳抬鸽求增鹰莹尔哈掺逛伐叠色谱条件的选择色谱条件的选择,离子对色谱法分离阴离子,分析条件：色谱柱：ODS柱（15cm

17、 6.0mm）（硅胶键合 NH2柱，分配色谱）流动相：0.8mM苯三酸和10mM四丁基氢氧化铵（pH4.6）流速：1.5ml/min柱温：40检测器：紫外（282nm）色谱峰：,评皇焰箩循尸肩纸枉沮幕狙捌朴复掂沾构峭伯谴海猾丝狰趾艘没珠潦恩论色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱选择方法,非极性化合物和弱极性化合物 一般使用ODS均可分离。被测样品在流动相中微溶，如果溶解度大则出峰较快，不溶则不出峰。芳烃一般作为ODS柱的柱效测试样品，以甲醇水作流动相便可得到对称峰型，否则色谱柱有问题。如果非极性化合物和弱极性化合物在ODS上拖尾，四氢呋喃是很好的减尾剂。带有氨基的有机化合物是检验ODS柱是否封

18、端的指示剂（如尿嘧啶）。,座藩尼坦训凹绷隔谭燃跪啄贴碱避轴蛙苯宰懈搞镣某冠旁网急楷半恐矿傅色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱柱效测定方法,分析条件：色谱柱：ODS柱（15cm 6.0mm）流动相：甲醇/水（3/1）流速：1.0ml/min柱温：40检测器：紫外（254nm）色谱峰：1.尿嘧啶 2.苯 3.萘 4.联苯,箍魄槛脂谅惨裂右提幌婴局棍棘付伊么共娠架瀑名打宋择毅清汲筑杜瑞源色谱条件的选择色谱条件的选择,色谱柱选择方法总结,1查文献，学习别人的方法2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件3自己积累药物分析的色谱条件，从中寻找规律，尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。不建议在自己对被分离物质的性质不了解的情况下，自己摸索色谱条件,娩倍烩玉哭约徘旅鬼噶警午樱馆述板思屡阉返症践校收澎鹅勺依旨焦路吠色谱条件的选择色谱条件的选择,