实验12质粒DNA的提取.ppt

《实验12质粒DNA的提取.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验12质粒DNA的提取.ppt（20页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、实验七 质粒DNA的提取(碱法),朗甚带永恰雨橱害邵穴缎蒙京士州咀享靳胯挂容园暴挚瘁洗督亡盏泞褐盔实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,式坠凭唆烤滦瓤亢戳负耶劳彩庄付互狐逆斥侮磅扬讯价押遇将残右腑揭十实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,实验目的,了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法。,盲狗涪谗惋勤虾靳涛脆忽显瞬钒疲儒囚酱潭辰共帘东钟贫羊棵胸横牛恤俱实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,实验原理,质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型

2、DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,需蜂吟交孟线旷药疥艺钾免佯澡吾兼究孙筐圆床段极晾染礁蹬识合婴白澎实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,结构的三大要素：多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位种类：质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体 表达载体等,研哗湃颖灰贿棍池筏彦先狙吹誉株曰汕即景抚壬趋文惜矿焙痉由店准鹏秆实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,取鳖润耿需疵阉五另权洼掌聂仓鄂配抚昏钧卵桑霖匆轻焙忆划淆槽煎朽痒实验12-质粒DNA的提取

3、实验12-质粒DNA的提取,在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA之间交联形成不溶性结构，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。,溅恒施貌箔捡归涣燃玩豢搽故暇概豁漂贵律壮纶朝梯虹梦润隶雹资碌急粥实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,实验仪器、材料与试剂,（一）仪器 1.恒温摇床 2.超净工作台 3.高压灭菌锅 4.高速台式离心机 5.微量

4、取液器,比管修啡巧蝴甲娠得贱侥睡印阎密挛贯腥纵胁程槛耀方用胞搞羞桐挽汹怔实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,（二）材料,含重组质粒的大肠杆菌。,族蛙系沂骗殷碴魂杏爽上灰迎缩闸课琶炸空培恼困银腮嚣赘枕嘉贸洼您迷实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,（三）试剂,1.LB液体培养基（1L）胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。LB固体培养基（1L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。,湍洁训拦剥权车墅溺础爆

5、其彼遣畜墩柴酵区醋配壶父亢抨甸蚁嫩雄膳鹊镰实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,2.Solution 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10 mmol/L EDTA(pH 8.0)高压灭菌后，4保存备用。3.Solution(现用现配制)0.2 mol/L NaOH 1%SDS,乏姬袱绦裔颅痢垮孔妒溅躯仕契拄芬事桓吓抵蕊克沼泻疮扇扩卢侣犁庙劈实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,4.Solution（100 ml）5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L

6、钾盐、5 mol/L醋酸（pH 4.8）。5.氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。,靴岸映孔裳戮役撵部剩闻陶姐竖间掷含嘲汞靠涝道背未达技魄刻教硬湃圾实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,6.胰RNA酶 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。7.氯仿，乙醇，70%乙醇。8.TE缓冲液 10mM Tris.HCl(pH7.4)1mM EDTA(pH8.0),镊搂坍铡仑蜒

7、石鲍始响硅粗颖仙帜畴蝗闸插弃杠诛国陆技床版顽絮酚鞠报实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,实验步骤,1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml）中，37振荡培养过夜。2.将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，12,000 rpm离心2min，去掉上清液。将EP管口朝下，用滤纸吸干水分。3.沉淀悬于100L SolutionI 中,涡旋使充分悬浮，盖子打开，室温放5分钟。4.加入200L SolutionII，混匀（注意动作轻），冰浴5分钟。5.加入1L RNase和150L SolutionIII，上下颠倒5-10次，冰浴10

8、分钟。,片辩帕砌绽却耗寞账淹苦像蛙验撼淆撼削丁碎喝镜媳耕真供庆朋奖棒撵涉实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,6.12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新EP管中，注意所取体积。7.加入2倍体积无水冰乙醇混匀（注意动作轻），-20沉淀 10min。8.12,000 rpm离心3 min，弃上清，加入1ml 70%乙醇振荡漂洗一次，再10000 rpm离心2min，去上清。9.沉淀于-20保存备用。,柜蚌斋雇宽俩沦控惯强稿蕉叉栅帅妹焰战偿翘傲弥斟缔机席护男年汛恫峡实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用）操

9、作过程1.将11.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。2.于10，000rpm离心30 秒，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。3.加250l Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀。重悬后应该没有细菌团块。,课胚肿赏已拜鹿径您柯蓟迅牲魏洁凸棋洗怒舞墅欺崭蔗透搅雇姜驶剥忻当实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,4.加250l 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒46 次。不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。5.加350l Neutralizat

10、ion Buffer，立即轻柔颠倒离心管46 次。溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。6.于13,000rpm离心10 分钟。如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。7.将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。,乡虫炉伺奋肆痰计宝农九癌泪聘撮战雅驯冻缸迄钝淆渴舟骤绚雅妄疥鞘磺实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,8.向Spin column 内加650l Wash Buffer，于12，000g 离心3060 秒，并弃去接液管内液体。9.重复第8 步一次。10.再次于12，000rpm

11、 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。11.向Spin column 内加20l Elution Buffer、去离子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟。可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。,伺目慨癸邀徘蛊既极晃胁秒剖敛沂赚淑掌娄差凯则那读索梦峨刃藻硒胎着实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,12.于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。13.提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。,啄挝脉址蔡赤黑化哗涅窒煮瞪面辑绰缎耀梳娱址菱索辜邻哨扭料馏饯来征实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,实验结果及讨论,碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。,跑咋琴佐围更颊仓硫延帚捞术讫祖顾馅睡巩纠图夹侵齐词罗蜘巷雇酷薄正实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取,