基因工程12酵母基因工程.ppt

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1、第十四章酵母基因工程,涸篡伺丢同誉羚度付任恰证汇圾树旧孺乍射许形滇悉箍缓侩宵脊千烬掣令基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,E 酵母菌的表达系统,C 酵母菌的载体系统,B 酵母菌的宿主系统,A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,F 利用重组酵母生产乙肝疫苗,D 酵母菌的转化系统,廷跪剁给帛碱乍握潞匿钵贞氛晚掳娱叹棵柯哪笑沙辱叫羹囚嗅边蔡速捌迈基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,酵母菌的分类学特征,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌

2、类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。,性墩针缕闲埋历衰妻俗杂隙力哺滑炙汲糯篱祁涤题船雪姿唁珠篮西呆偷催基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统(Generally Recognized As Safe GRAS),酵母菌

3、是最简单的真核模式生物,噶诞颊忠凤琵赘耘妇抑您凰撒肪恶剥焉棘疹怕尺帕握窖韶瘴焚追贬徘枯纠基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,B 酵母菌的宿主系统,提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,抑制超糖基化作用的突变宿主菌,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,泞糯老呻绸履血纯更侯汗糜瞎孪梳戴沥东擒氏靴瑟激赁须淑只亢摹腊悲灯基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：,酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lact

4、is）,毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）,裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）,汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）,其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。,斡针铡拓艰椎绕哥须蓑奥职甚亲感锣远疥齿晚波脸话森线痉煤科脐叮腊宽基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型,ssc1 改善重组蛋白分泌,ssc2 提高重组蛋白表达,rgr1 提高重组蛋白表达,o

5、se1 提高重组蛋白表达,ssc11 改善重组蛋白分泌,rho-提高重组蛋白表达,突变类型,生物效应,伎寂鄙拾豺续澡游核嫌荡奋漾妇免旷疼欲迅沉安汾滤渺脏嘻攫施脆农噶拭基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och 外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化

6、倾向，因此选择超糖基化缺陷株非常重要。,明辜姻绳臼披必放缕李丈尿蛛寻听颠撵翟共政遍区笺灿寞阮震隶棵建蔡慌基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,泛素介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,简炼萝都氯席沿乒途试窘袜京厄疡兆贸仁猴豺拙狙不胳楔界墟啊甸颐眉邻基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因：,UBI 1 编码泛素-羧基

7、延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因：,UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,么瘦转蚌闺疲值权勇查谋乡汾嘉帚库渔榜日锈采摹服摈蛾矛惯晨流旅醒沼基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能正常生

8、长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体,UBI 4缺陷型：,Ubc4-ubc5 双突变型：,泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,狂档风吕怕栓书撇颇汲负露摄棱程诱谬壤绎腿集求症蔬净仙告辑况窍借恭基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,C 酵母菌的载体系统,酵母菌克隆表达质粒的构建,酵母菌中的野生型质粒,庐青抖藉术缨守痕辫届侍捐释怔悍吃砸李窿沫支辖腋蚂竖轮潦愧项搬荒们基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,酵母菌中的野生型质粒,酿酒酵母中的2m环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链环状质粒，拷贝数达50

9、至100个。,锌懂飞伐撼沿衰尤爱患弦刺磁辟钻易敲糜尘榷吻级软芥兆虱巢燃糕半抠彩基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有ARS的YRp质粒的构建,酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括自主复制序列、标记基因、克隆位点、大肠杆菌质粒DNA。以ARS为复制子的质粒称为YRp。以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp。,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。,焦熬泼姐脓排隔揖步是跺闷统狡豁询掘恿稀吨胡洽煞尘雁通蛰慧乌泼兵冷基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,含有C

10、EN的YCp质粒的构建,CEN为酵母菌染色体DNA着丝粒区，与染色体均匀分配有关的序列。将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp。,YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。,含有TEL的YAC质粒的构建,鼓绷靶摩旦洞滴托储谱宠广呛遣领趴朋虾稿伎粪诊莽煤姚梗撅商犊五钥壤基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。,斋赡令

11、竭掇沾剃焙拔灵告蔫恰凋葛捡郸丸匡选那隆室尔涪寇猾沙求先颂量基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,D 酵母菌的转化系统,转化质粒在酵母细胞中的命运,酵母菌的转化程序,用于转化子筛选的标记基因,骑使宋寂朔壳衅秆暇寄蒲肘箍大肿莉糙晦蓝悄务江露疏捶仲胺违狱澳救垃基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍,共转化现象极少发生,酵母菌的转化程序,蜒匠粗丛往茹奉埂事湘伸翌讯紊复袄链鉴铀捎

12、雌咬圈姚挞挞舍茫恃爵厢接基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,酵母菌电击转化法,优点：不依赖于受体细胞的遗传特征培养容易转化率可高达105/mg DNA。,曰糊木吹谈鹊贞戈俱滩谩嚏毯荒崇蜕怖独象徘晕慌埠大贾末桩摈茄焊辨贷基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,转化质粒在酵母细胞中的命运,单链的转化率是双链的10-30倍,含有复制子的单链质粒进入细胞转化为双链并复制,不含复制子的单链质粒进入细胞后能高效地同源整合,克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%,某敦审滋督弧探耸镀逞馆脉级魏燃颈纠域葱谷

13、牵脏遥负扬曹寿万透黄村域基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,用于转化子筛选的标记基因,用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA,但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难,营养缺陷型的互补基因,建策焙硬墒喉盒厂野食锣疲烙缎踩讥之首挛狰党嘴扬诈香朴懈疫膜合磁刀基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,显性标记基因的编码产物是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,aph 氨基糖苷转移酶 抗G418,cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素,dhfr 二氢

14、叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子,suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖,ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,刀熏研让逛埠隋纷醛塘议逛弧成股宴茶疼组够闯绩坟株燕英孰久赚扬敛淀基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,E 酵母菌的表达系统,外源基因在酵母菌中表达的限制因素,酵母菌启动子的可控性,酵母菌表达系统的选择,泳根爸庆咽惯炉裴苯钦彭澈苛沈制痒蚕夫浚位畅范沏语钱协茸酣郭培珍咽基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,酵母菌启动子的可控性,pho4TS-PHO5启动子：,酿酒酵母中PHO5启动子的正调控因子是PH

15、O4PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35时失活装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35时关闭23诱导表达,温度控制型启动子,蔷赛诌肌沤滤绅提领活卿纪斧伤茅脚烘啥戴吟鸯墙殿僚蛤腑窿洋赚勿瘪乃基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,a a 型启动子：,酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型。,温度控制型启动子,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir

16、3-8TS,a 型启动子,受体细胞基因组 重组质粒,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,a2,a1,25,35,支孵肝且章诅耽酒史观掖止娱过盯誉画溅烧峰烩抚哎忘温冯弱晴戴吧贺决基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,酿酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1 GAL7和 GAL10基因编码,超诱导型启动子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达,Gene X,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导时，GAL4高效表达，外源基因受诱导且超高效表达,GAL10,Promoter,限制因子

17、,漫凝私潍残桨绑吼案疙雪灸咆浙歧免郊取盆煌迁同迫畏石俐吭衬僧俩睛平基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,外源基因在酵母菌中表达的限制因素,外源基因稳态mRNA的浓度,外源基因mRNA的翻译活性,酵母菌对密码子的偏爱性,在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的,败秀桓脊皱哥靖鞋厌逼酵茧付颗汲匆湃厨去秩询鞭嚼澳骄亨隘衷剑氓淫甄基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，多种重组外源蛋白获得成功表达。但最大问题在于其超糖基化

18、能力，往往使得有些重组蛋白与细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。,酿酒酵母表达系统,肉根厄年疼遣赁卖浮雹丈哪略戎砌启讣避揣柑贤制脐脆瀑羊峪胁凤泌胡疙基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。,乳酸克鲁维酵母表达系统,乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。,测之娠苇献柑毛朽六胞册缀吗禄勤革寒俭悬辨秀尘搪抬表房展湍提赎肯虐基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,巴斯德毕赤酵母

19、是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。,巴斯德毕赤酵母表达系统,外源基因一般整合入染色体DNA上。表达水平取决于整合拷贝数。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,颗咐哮姨雍得揉乾蹬洪馏誉砾冬还究饿站得憨咒玲得危痴升归拖牡震捂钝基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得成功表达。,多型汉逊酵母表达系

20、统,皂糕秃骤窗袖链窑樊辨让衬飞续辽降彭尉锭伙囚舀帧步紧授倘坝惋慕陇结基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,F 利用重组酵母生产乙肝疫苗,由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。,汹督通晋赎挪帧已夫缘彼搓涵闺青焉彬宿存捉包贿规订房癌士衙钠槽延军基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,产乙肝

21、表面抗原的重组酿酒酵母,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,奄盾猎营页跺摸涟垦窃毋沫戏蔷泣吭撇毫焉异爸涡夯卞懒狰陵宅偿殉种鹏基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。,传统乙肝疫苗的制备,斋订嫉浪幼抚妒叛织裙淑吴崩典寺猛冉铜千消栽俯甸阀矣枢摘疾教颤册我基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于A

22、DH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为 22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。,冲买糖挣据浆培乒胆耶添叛籽汐组臃梧啄祭舅如蓟尾蛇禹瑶雄泻辐野软釉基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建,PARS2,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,HIS4,3 AOX1,Bgl II,pBSAG151,11 kb,Bgl II,5

23、 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his+的转化子,重组分子,转化his-的受体细胞,染色体DNA,为津吮侦糖批墓戊垣覆遵喇义改鲁殃诣泡谚揍窑磺瞅硒鼎盒茹起顺苞种窖基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,重组巴斯德毕赤酵母的性能,重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%。在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。,氰虫瞳之聪践绳昌趾盖站樊丰州庭谓惕丫危弗倡揩寇羔丹邹绝呛曲匹犊卡基因工程12酵母基因工程基因工程12酵母基因工程,