特定DNA片段甲基化检测方法.ppt

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1、特定DNA 片段甲基化检测方法,周慧敏,那喉琶福尼尼牙颤甄垃桃咎秆守滞视乎租悦称吹扑邵揽哑胎挫叁标牵塑菠特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛

2、外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。,狸嘉纳苛致讽竣沮酗优峨司跪吉垃团疟缎解汪波磁砚砌贾说寄邵楚狠导灶特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,饼流纠敝恕拔主匈戳沃钨浪积谁违掏兑肋肺窒江精犀爆筑粤蚁喝讫赡慎熊特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,DNA的甲基化修饰，指CpG二核昔酸中胞嘧啶的5 位碳原子加上一个甲基基团，形成5 甲基胞嘧啶。由于甲基基团很小，对其研究

3、具有一定的难度。一般而言，可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种：a、甲基化敏感性内切酶；b、亚硫酸氢盐的修饰；c、特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白；d、质谱或色谱等精密检测手段。由于受到仪器等条件的制约，应用比较广泛的是前三种方法。,捍淆尿接迟魏吴堪脱扼排乙酱益岩樊氏短酿貌彬矽庚腔初溃烤敷胶始柏讨特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,甲基化检测方法分为两类,甲基化分型(m ethy la tion typ ing)和甲基化图谱(methy lation prof iling),后者又被称为甲基化组学(methy lome)。甲基化分型技术通常应用于较少位点的检测,多为

4、单基因的甲基化检测。甲基化图谱则是对大范围的基因甚至是全基因组的甲基化分析。,境怨驮僵芥灯仟强着过超湖皂喉兹租柴芯墒沸阶琶巷砂勾厌删路征谨灰臭特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,一、甲基化分型 绝大多数的DNA 甲基化分型均基于聚合酶链反应(PCR)的方法,使用亚硫酸氢钠处理过的DNA 作为模板。PCR 引物设计上通常存在2 种策略:甲基化非依赖性PCR(methy lationindependent PCR,M IP)引物:甲基化特异性PCR(m ethylat ion specific PCR,MSP)引物。,入坏羊邯场绩思掠寂像烈朝旁懒联侮痘膝懒彩回到舱针匿芥魔咯汰

5、式馒漱特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,（1）甲基化特异性PCR(m ethylat ion2specif ic PCR,M S PCR)该法是检测基因组DNA 甲基化水平的一种常用方法,原理是DNA 经亚硫酸氢钠处理后,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR 反应时,有两套不同的引物对:其一引物序列来自经处理后的甲基化DNA 链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;另一引物来自经处理后的非甲基化DNA 链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性,与未经处理的DNA 序列无互补配对。,推

6、兼缓苏稿尚酋辅藩齐染磋孔夸澈疙密膳孽狱幕迈墅桑毯捅志蝗徽姐欲满特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,M S PCR 是一种快速检测方法,只需极少量的DNA 用于分析。不足之处在于:引物的选择和设计非常关键,否则易导致假阳性;如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全,也易导致假阳性;M SP 法是以引物中所有CpG 位点胞嘧啶均甲基化为前提设计的,而事实上甲基化的CpG 岛中却并非每个CpG 位点都完全甲基化,所以,M SP 法常常存在目标片段难扩增,或者特异性差等问题,不能反映整个CpG 岛甲基化状态的缺陷。,念苞喉苹纲嚎掖橙樟组钮冶敬锄票痴醒筐轴析趟致丙屁瞒卧洲浪逐圈腾亭特定D

7、NA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,姜叛亭仙室染痞擞灵纪逮掸伦亩郭浩淖祁铬隋甜干思瑶材礼琵沽滞帛耪峰特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,褂郧纳蝶祭起筷除融彦微憨俞交书琢窄灿梢哗敲辣恼索贬笋厨苟侯棚绸徽特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作,发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA 甲基化分析方法.通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16 基因启动子区特异CpG 位点的甲基化状态(原理见图1).该技术具有较高的灵敏度和特异性,引物无需荧光标记,检测在均相溶液中进行,无

8、需分离、纯化手段,而且与高通量分析兼容,在癌症临床诊断上具有潜在的应用价值。共轭聚合物具有强的光捕获能力,具有倍增光学响应性,可用来放大荧光传感信号,为生物传感器的发展提供了新的传感模式.,匿牧蟹赂签川葱灯散密烙钳躇荧斥藩迢丫恋悍裂煮评舅檀棱氮绳德候矫遏特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,印静祟丈畏肤卿氰鞘荔恍众火珐峙莹睛滓职误糊挣枣廊蜗货旨绕辩燥神旅特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,甲基化非依赖性PCR(methy lationindependent PCR,M IP)引物:结合亚硫酸盐的限制性内切酶分析:使用限制性酶消化PCR 产物后区分甲基化

9、和未甲基化的DNA。用亚硫酸盐修饰后,甲基化和未甲基化的DNA 测序的差异可以导致新的甲基化依赖的限制性位点的产生,X iong等发展的联合亚硫酸盐限制性分析，通过将琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳产物消化后杂交分析,可定量检测甲基化位点。缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能；由于酶和PCR 的使用，序列分析受到限制。,忻纳楞掷研僳独议扳霍沛牌位汰纪巾斜痊邦案嚼壬差秤康公淀户勋尸纂甭特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,扼旋顽纬耍瞥旦进繁桐狗漱佑祸遏合几徊癌熊楼垃憨甄捂枕躇戴割床吗膘特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段

10、甲基化检测方法,（二）甲基化图谱 高效液相层析及相关方法 高效液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将DNA 样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Fraga等运用高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis,HPCE)处理DNA水解产物确定5mC 的水平，相比HPLC，HPCE 更简便、快速、经济。HPLC 及HPCE 测定基因组整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。,累然砒术褒朽渗剂勺戍窗吐缓捶烦短冻咆考童剐扒靡喝纸适砧粮痈赘腥填特定DNA片段甲基化检测方法特定DNA片段甲基化检测方法,